Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Артюхов В.Г. -> "Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" -> 104

Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.

Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами — Воронеж, 2000. — 296 c.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani2000.pdf
Предыдущая << 1 .. 98 99 100 101 102 103 < 104 > 105 106 107 108 109 110 .. 113 >> Следующая

В процессе выделения ЛДГ содержание белка на различных стадиях необходимо контролировать по методу Лоури (см. лабораторную работу № 2),
Степень гомогенности полученного препарата анализируют методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (см. лабораторную работу № 20).
Лабораторная работа № 20
Исследование изоферментного спектра лактатдегидрогена-
зы методом электрофореза в полиакриламидном геле
Определение изоферментов ЛДГ методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле основано на различиях в зарядовом состоянии и электрофоретической подвижности молекул разных изоформ белка.
Материалы и оборудование', соляная кислота, трисгидрокси-метиламинометан (трис), ТЕМЕД, акриламид, бисакриламид (БИС), персульфат аммония, рибофлавин, сахароза, бромфеноловый синий, феназинметасульфат, нитросиний тетразолиевый, хлорид магния, хлорид натрия, фосфатный буфер (pH 7,4), NADH, лактат натрия, уксусная кислота, парафин, установка для диск-электрофореза, термостат, денситометр, ртутно-кварцевая лампа.
Ход работы
Для получения мелкопористого (5,5 %) геля, в котором: осуществляется разделение веществ в соответствии с их зарядом и молекулярной массой, необходимо смешать 1 объем раствора А (48 мл 1 н НС1, 36,6 г трис и 0,23 мл ТЕМЕД на 100 мл бидистил-лированной воды), 2 объема Вщ (28 г акриламида и 0,735 г БИС в 100 мл дистиллированной воды), 4 объема раствора 2 (0,14 %-ный раствор персульфата аммония) и добавить 1 объем дистиллированной воды. Осторожно перемешав стеклянной палочкой полученную смесь, внести по 2 мл ее в каждую трубку (один конец трубки заклеить и загерметизировать расплавленным парафином). Для предотвращения ингибирования молекулярным кислородом процесса полимеризации геля и формирования ровной поверхности последнего сверху раствора наслоить бидистилли-рованную воду на высоту 5—7 мм. Процесс полимеризации заканчивается через 30—40 мин, о чем свидетельствует появление четкой границы раздела между гелем и водой и легкое нагревание трубок.
На слой разделяющего геля нанести 0,2 мл концентрирующего крупнопористого геля (7 %), который готовят смешиванием 1 объема Бщ (24 мл 1 н НС1, 2,99 г трис и 0,23 мл ТЕМЕД на
50 мл бидистиллированной воды), 2 объемов раствора Гщ (5 г ак-риламида и 1,25 г БИС в 50 мл воды), 1 объема Дщ (0,004 %-ный раствор рибофлавина) и 4 объемов раствора Ещ (40 %-ный раствор сахарозы). Полимеризация протекает за 10—15 мин в условиях облучения светом ртутно-кварцевой лампы. Для исключения контакта с кислородом воздуха на гель также аккуратно наслоить воду на высоту 3—5 мм.
С поверхности заполимеризовавшегося концентрирующего геля удалить воду и внести образец (смесь изоферментов ЛДГ, разведенную 40 %-ным раствором сахарозы в отношении 1:1) в количестве 0,2 мл. Наслоить раствор лидирующего красителя (0,001 %-ный раствор бромфенолового синего). Эта часть колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером при электрофорезе, поэтому верхнее наслаивание заканчивается электродным буфером. Наслаивание проводят очень осторожно, избегая перемешивания образца с буфером, во избежание потери вещества.
Состав электродного буфера (pH 8,3): 6 г трис и 28,8 г глицина на 1 л бидистиллированной воды. Перед использованием его необходимо разбавить в 10 раз.
Собрать прибор для диск-электрофореза, поместить его в холодильник и подсоединить к соответствующим полюсам выпрямителя тока. Первые 15—20 мин электрофореза сила тока не должна превышать 0,002 А на каждую трубочку. Такая низкая величина тормозит движение мелких частиц образца в раствор верхнего сосуда. По истечении этого срока силу тока увеличить до 0,004—0,005 А на гель.
После окончания электрофореза извлеченные столбики поместить в красящую смесь для проявления изоферментов ЛДГ.
В основе тетразолиевого метода выявления локализации ферментов в гелях лежит образование нерастворимых хромогенных веществ — формазанов. Схематически их образование может быть представлено последовательностью реакций: NADH + феназинметасульфат (ФМС) —» ФМС воост
ФМС восст + нитросиний тетразолиевый (НСТ) —>
—> НСТвосст (диформазан, окрашенный продукт)
ФМС выступает в качестве переносчика электронов в цепи реакций.
В состав инкубационной среды входят 8 мл 1 моль/л раствора лактата натрия, 4 мл раствора NADH (10 мг/мл), 8 мл ОД моль/л раствора NaCl, 8 мл 0,005 моль/л раствора MgCl2, 10 мл 0,05 моль/л фосфатного буфера (pH 7,4), 2 мл раствора ФМС (1 мг/мл) и 20 мл НСТ (1 мг/мл).
Каждый столбик ПААГ поместить в отдельную пробирку, залить инкубационной смесью и поставить в термостат при температуре 37 °С на 1—1,5 ч (или инкубировать при комнатной температуре в течение ночи). По истечении срока инкубации гели ополоснуть водой и перенести в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты (7 %). При температуре 5 °С и в темноте диск-электрофореграммы изоэнзимов ЛДГ могут сохраняться не более
7 дней. В течение этого срока их денситометрируют, изображают графически изоферментный спектр ЛДГ (по оси абсцисс — длина столбика геля, по оси ординат — оптическая плотность), затем определяют содержание каждого изофермента весовым методом.
Предыдущая << 1 .. 98 99 100 101 102 103 < 104 > 105 106 107 108 109 110 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed