Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Каталитическую активность глутатионредуктазы выражают в мкмолях превращенного NADPH в 1 мин на 1 мл эритроцитов.
6.8. ИЗУЧЕНИЕ УЧАСТИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССАХ УФ-МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
Для выявления участия активных форм кислорода в процессах фотомодификации белковых молекул проводят модельные эксперименты с использованием растворов биополимеров (в частности, лактатдегидрогеназы), а также акцепторов и тушителей активных кислородных метаболитов.
Одним кз распространенных тушителей синглетного молекулярного кислорода является азид натрия NaN3. Это соединение обладает широким спектром действия, что обусловлено электронной конфигурацией его молекул. Группа — N3 линейна:
-N = N+= N : <=> -N - N+ = N: <=> -N - N = N:+
Ее строение представляет собой суперпозицию трех резонансных структур с частичными зарядами у различных атомов азота. Вероятно, это способствует взаимодействию иона азида с комплементарными участками аминокислотных остатков белковой глобулы. Азид натрия используется как эффективный ионофор, его органические производные применяют в химической энзи-мологии в качестве фотореактивируемых поперечносшивающих агентов.
D-маннит — широко распространенное в природе вещество — обладает сродством к ОН-радикалам. Кроме того, его фотопро-текторное действие может быть связано с образованием комплекса белок—спирт, более резистентного, чем свободный биополимер.
Серотонин (5-гидрокситриптамин) является биологически активным веществом из группы индолилалкиламинов:
НО
н
Он принимает участие в различных физиологических процессах. Его рассматривают как химический медиатор нервных возбуждений, антидиуретический гормон, гемостатический агент, фактор роста, медиатор аллергических реакций и др. Установлено, что серотонин проявляет выраженный фотопротекторный эффект по отношению к молекулам гемопротеидов (феррицитох-рома С, каталазы и оксигемоглобина). По всей вероятности, защитное действие этого биогенного амина может быть обусловлено как конкуренцией его молекул за активные частицы (первичные и пероксидные радикалы) УФ-фотолиза водных растворов белков, так и образованием комплекса серотонин — биополимер, более резистентного по сравнению со свободным белком.
Лактатдегидрогеназа — гликолитический фермент, катализирующий обратимую реакцию окисления молочной кислоты с
образованием пировиноградной кислоты в присутствии кофер-мента NAD (см. раздел 4.3).
ЛДГ обнаруживается во всех клетках и биологических жидкостях. Следует обратить внимание на тот факт, что уровень фермента в эритроцитах в 100 раз выше, чем в сыворотке. Поэтому при определении его активности в сыворотке крови гемолиз эритроцитов должен быть полностью исключен. Также необходимо быстро отделять сгусток от сыворотки. Активность ЛДГ могут подавлять гепарин и оксалат.
Повышение активности ЛДГ имеет место при некрозе тканей, особенно при остром поражении сердца, повреждении эритроцитов, почек, скелетных мышц, печени, легких и кожи. Значительное увеличение активности фермента сопровождает гемолитические анемии, связанные с дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты, а также эритремию. Возрастание уровня ЛДГ характерно для острой фазы инфекционного гепатита.
Определение изоферментного спектра ЛДГ также используют в диагностических целях. Изоферменты сывороточной ЛДГ выявляются после электрофореза при pH 8,6 на крахмальном, агаровом или полиакриламидном гелях. При инфаркте миокарда обнаруживается увеличение содержания ЛДГ 1. Относительное повышение уровня ЛДГ 4 и 5 наблюдается при остром гепатите, тяжелом мышечном повреждении, дерматомиозите, мышечной дистрофии.
Лабораторная работа М 18
Исследование каталитической активности лактатдегидрогеназы спектрофотометрическим методом
Принцип метода. В основе данного определения функциональной активности ЛДГ лежит метод Берг-Мейера, сущность которого заключается в оценке скорости окисления NADH, регистрируемой спектрофотометрически при длине волны 340 нм.
Материалы и оборудование: 0,1 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 7,4), пируват натрия, буферный раствор лактатдегидрогеназы из сердца свиньи или скелетных мышц свиньи, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы, стеклянные пипетки и пробирки, фильтровальная бумага, секундомер.
Ход работы
Если в работе используется коммерческий препарат ЛДГ из мышц свиньи (кристаллическая суспензия в 2,2 моль/л сульфате аммония), то он должен быть предварительно обессолен методом гель-хроматографии на колонке (15x1,5 см), упакованной сефадексом G-25. Выделение ЛДГ из сердца свиньи проводят по методике, описанной в лабораторной работе № 17.
Концентрацию растворов фермента определяют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 1,96*10б л (моль-1 * см-1) для мышечной и 0Д96-105 л (моль-1 -см'1) для сердечной изоформы.
Реактивы (указаны конечные концентрации)
