Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Артюхов В.Г. -> "Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" -> 101

Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.

Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами — Воронеж, 2000. — 296 c.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani2000.pdf
Предыдущая << 1 .. 95 96 97 98 99 100 < 101 > 102 103 104 105 106 107 .. 113 >> Следующая

Гемоглобин осаждают хлороформ-этаноловой смесью (1:5). Для этого к 1 мл гемолизата добавляют 200 мкл хлороформ-этаноловой смеси. Затем гемолизат центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Отбирают супернатант и в нем определяют активность каталазы, предварительно разбавив его бидистиллированной водой в соотношении 1:10.
в) Определение функциональной активности каталазы
Принцип метода. Определение активности каталазы основано на ее способности высокоэффективно катализировать реакцию разложения пероксида водорода на воду и кислород.
Реакционная смесь содержит следующие растворы:
1. Фосфатный буфер (0,01 моль/л), pH 6,7 — 0,5 мл.
2. Этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (10'4 моль/л) — 0,5 мл.
3. Пероксид водорода (0,015 моль/л) — 2 мл.
4. Исследуемый образец — ОД мл.
Для определения активности каталазы в контрольную и опытную пробы, содержащие исследуемый ферментный раствор, добавляют фосфатный буфер, пероксид водорода и ЭДТА. Пробирки оставляют на 10 мин при комнатной температуре, предварительно остановив реакцию в контрольной пробе добавлением 1 мл
10 %-ного раствора серной кислоты. Такой же объем серной кислоты добавляют в опытную пробу после окончания инкубации. Каталазную активность определяют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 250 нм.
Холостая проба для учета спонтанной реакции разложения пероксида водорода отличается тем, что вместо образца, содержащего ката лазу, в нее добавляют такой объем фосфатного буфера.
За единицу активности (А) принимают такое количество (в молях) пероксида водорода, которое’разложилось при инкубации в единицу времени:
А = —1 с* - (моль/мин на 1 мг белка),
Dx • Vj • с2 • t
где AD — разность оптических плотностей опытной и контрольной проб; Dx — оптическая плотность холостой пробы; Vj — общий объем инкубационной смеси; V2 — объем исследуемого образца; с1 — концентрация Н202; с2 — концентрация белка в пробе; п — фактор разведения; t — время инкубации.
Лабораторная работа № 17
Исследование функциональной активности глутатиоиредуктазы эритроцитов
Глутатионредуктаза (NAD(P)H: окисленный глутатион-окси-доредуктаза), фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий восстановление окисленного глутатиона:
GSSG + NADPH + Н+ -» 2GSH + NADP+,
где GS — остаток глутатиона; NADPH и NADP"1' — соответственно восстановленные и окисленные формы кофермента никотии-амидадениндинуклеотидфосфата.
Глутатионредуктаза состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой каждой 50—55 тысяч: полость между ними в ходе реакции- занимает глутатион. Субъединицы содержат по 4 структурных домена, на одном конце которого расположен остаток флавинадениндинуклеотида, на другом NAD(P)H-cbh-зывающие участки. Наиболее полно изучено строение глутати-онредуктазы эритроцитов человека, субъединица которой состоит из 478 аминокислотных остатков и содержит по 30 % а-спи-ралей и (3-структур.
Активность глутатиоиредуктазы в сыворотке крови повышается при инфаркте миокарда, онкологических заболеваниях и гепатитах, а в эритроцитах — при наследственной недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что позволяет использовать определение уровня глутатиоиредуктазы в диагностических целях.
Материалы и оборудование: кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,067 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 6,6), окисленный глутатион, NAJDPH, центрифуга MPW-340, центрифужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для
спектрофотометра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Получить отмытые эритроциты по методике, описанной в лабораторной работе № 1. 0,5 мл эритроцитарной массы гемолизи-ровать с 10 мл 0,067 моль/л фосфатного буфера (pH 6,6) и оставить на холоде 15 мин.
С целью осаждения гемоглобина к 1 мл гемолизата добавить
0,2 мл хлороформ-этаноловой смеси (1:5), тщательно перемешать, выдержать на холоде 5 мин и центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант использовать для определения активности глутатионредуктазы.
0,1 мл супернатанта добавить в спектрофотометрическую кювету, содержащую 2,9 мл 0,067 моль/л фосфатного буфера (pH 6,6) с 0,027 ммоль/л окисленного глутатиона и 0,02 ммоль/л NADPH. Оптическую плотность раствора измерить при длине волны 340 нм на спектрофотометре СФ-46 сразу после добавления супернатанта и через 5 мин после инкубации реакционной смеси. Активность глутатионредуктазы (А) рассчитывают по формуле
Л:,ДР340-Уцр-д
е •/• V X '
ь ‘ г сушр 1
где AD840 = Dx - D2 — изменение величины оптической плотности реакционной смеси за 5 мии; Vnp — конечный объем пробы
(3 мл); q — фактор разведения эритроцитов; в — молярный коэффициент поглощающего соединения (NADPH), равный 6,2-10а л (моль-1-см-1); I — длина оптического пути, см; Vcynep — объем добавленного супернатанта (0,3 мл); t — время инкубации реакционной смеси (5 мин).
Предыдущая << 1 .. 95 96 97 98 99 100 < 101 > 102 103 104 105 106 107 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed