Введение в методы микроскопического исследования - Аппельт Г.
Скачать (прямая ссылка):
б) слабо окрашенные препараты заключают в среду с другим показателем преломления, чем у составных элементов препарата.
В связи с этим сошлемся на таблицу показателей преломления отдельных сред для заключения объектов (см. главу 3, раздел 3.5).
Далее, для освещения может быть использован цветной свет. Установка по методу темного поля при этом не меняется. Разница заключается в том, что между осветителем и зеркалом микроскопа помещают цветной светофильтр, избирательно пропускающий только один цвет. Применение находят, следовательно, только строго синий, строго красный или строго зеленый фильтры; для некоторых исследований применяют фильтры, пропускающие цвета двух областей спектра. Благодаря этому некоторые структуры иногда резко выделяются на фоне окружающей среды.
Для наглядности приведем следующий пример.
В мазках из мокроты туберкулезные палочки, окрашенные карбол-фуксином и метиленовой синькой, в условиях обычного освещения выглядят красными, а остальная масса — синей. В темном поле становятся видимыми дополнительные цвета. Бактерии светятся зеленым светом, а фон — желтокоричневым. Если теперь поместить по ходу лучей строго
синий фильтр, то желто-коричневый фон препарата исчезнет, и бактерии будут светиться зеленым светом на фоне черного поля.
Хорошие изображения дают препараты, слегка окрашенные по методу Романовского-Гимза или карбол-фукси-ном с метиленовой синькой.
При правильном подборе цветных фильтров можно значительно повысить контрастность мельчайших составных частиц в отношении их яркости по сравнению с окружающей средой; это происходит потому, что дифракция цветного света на мельчайших частицах больше, чем в окружающей среде. Поэтому бактерии выделяются из окружающей среды благодаря своему сильному свечению.
2. Освещение изображения по методу Гофмана.
При наблюдении окрашенных гистологических и бактериологических препаратов в темном поле изображения выглядят как бы потрескавшимися, так как крупные тканевые элементы засвечивают более мелкие и осветляют темное поле; мельчайшие частицы становятся совсем невидимыми. Эти затруднения могут быть устранены с помощью матового стекла, которое помещают между осветителем и зеркалом микроскопа. Изрезанность исчезает, препараты светятся цветным светом на темном фоне. Засвечивание отсутствует. Мельчайшие частицы отчетливо видны наряду с крупными.
Матовое стекло должно быть обращено своей матовой стороной к микроскопу; его помещают как можно ближе к осветителю. Установку освещения по методу темного поля всегда следует производить без матового стекла. Когда она закончена, вставляют стекло.
Преимущество описанного метода по сравнению с обычным методом темного поля состоит в том, что он позволяет значительно отчетливее видеть мельчайшие составные частицы окрашенных препаратов, что делает более удобной их демонстрацию. Кроме того, легче производить подсчеты. При слабой или выцветшей окраске мельчайшие образования могут быть все еще хорошо различимы, в то время как в иных условиях это невозможно.
6.6. УЛЬТРАМИКРОСКОПИЯ
Как уже было сказано в настоящей главе (раздел 1), освещение по методу темного поля не может повысить разрешающую способность объектива.
Тем не менее при боковом освещении в темном поле становятся видимыми значительно более мелкие объекты, чем в светлом поле; это объясняется тем, что маленькие частицы, освещаемые лучами, падающими сбоку, начинают
сами светиться. Если рассматривать в темной комнате падающий сбоку луч, то в нем можно заметить бесчисленные танцующие точечки — пылинки, которые мы обычно не видим. Каждая из них сияет, как маленькое солнце, и испускает во все стороны лучи. Вокруг пылинки расположен световой венчик, который настолько велик, что глаз в состоянии его различить, в то время как сама пылинка остается невидимой. Величина и форма световых венчиков не позволяют судить о форме и величине пылинок — они лишь позволяют констатировать их присутствие. Поскольку возникновение светового венчика является следствием дифракции света, его называют дифракционной фигурой.
В темном поле микроскопа вокруг объектов, которые вследствие своей ничтожной величины не могут быть разрешены данным объективом, также возникают дифракционные фигуры. Микроскопические частицы, лежащие в их основе, называют «субмикронами»; они могут быть обнаружены лишь ультрамикроскопическим методом. При применении объектива с меньшей апертурой объект, который прежде можно было обнаружить микроскопическим методом (применяя объектив с большей апертурой), становится различим лишь с помощью метода ультрамикроскопии. Переход от микроскопического наблюдения к ультрамикроскопи-ческому зависит от величины апертуры объектива.
Поскольку дифракционные фигуры вокруг с у б м и к-р о н о в всегда бывают круглыми, даже если они окружают линейные частицы, легко представить себе, с какими оптическими ошибками встретится наблюдатель. Нельзя с точностью установить переход от микроскопического видения к ультрамикроскопическому. Нередко бывает так, что линейные объекты в продольном направлении различаются микроскопически, а в поперечном диаметре, — ультрамикроскопически. Поэтому лучше избегать описания строения частиц в темном поле без соответствующих исследований в светлом поле.
