Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Необходимо отметить, что амиды N-ацетиламинокислот выпадают из указанных корреляций, однако данных по влиянию боковой цепи субстрата на гидролиз таких амидов очень мало.
Сложнее обстоит дело в случае трипсина. Константы скопости второго порядка (fe2/Km) для реакции триппинь с эфирами ациламинокислот, содержащими короткую боковую цепь (глицин, аланин, масляная кислота), близки соответст-вуювдм константам их гидролиза химотрипсином (табл.44). То же самое наблюдается и для констант скорости деацилирования различных ацилхимотрипсинов и ацилтрипсинов [19751 (ср. табл.43). Однако скорость гидролиза трипсином резко возрастает при введении в боковую цепь на достаточном удалении от С -атома положительного заряда.
Таким образом, на стадии ацилирования специфичность трипсина определяется как гидрофобными взаимодействиями боковой цепи субстрата с ферментом, так и наличием заряда, причем последнее увеличивает скорость ацилирования в
Таблица 44. Кинетические параметры гидролиза сложных эфиров ациламинокислот трипсином [1977-1979]
Субстрат A,. o_1 V о-1 К .ю3, м fe2/Ks, M“V1
в
AcGlyOEt 0,032 0,1 830 0,04
AcAlaOEt 0,25 - 36 6,9
AcButOMe 7,6 'Л 0,47 16
ГО
«
AcPheOMe 55 173 110 5И02
AcTrpOMe - 31 -
AcTyrOEt 36 193 47 7.6.102
TosOmOMe 54 5,4 16 3,4•102
BzLysOMe 5,9-103 22,3 4,9 1 ,2•106
BzArgOMe 2-104 23,3 2,2 4,6 ¦ 106
*Для бензоилцроизводного.
102—103 раз. Что же касается стадии деацилирования (&3), то здесь зарядовое взаимодействие, по-видимому, не играет существенной роли: величины &3 для ацилхимотрипсинов и ацилтрипсинов весьма блкзки.
Следует отметить, что в отношении n-нитрофениловых эфиров Карбоновых кислот трипсин менее чувствителен к гидрофобности ацильной группы. Соответствующее корреляционное уравнение для этой серии субстратов [1980]
*2
lg— = (0,34±0,06)ти - (4,4+0,1 ) (50)
К
В
имеет коэффициент при тс вдвое меньший, чем этот же коэффициент для гидролиза таких субстратов а-химотрипсином (0,74) [1970]. Корреляционные уравнения рассмотренного типа были предложены для субстратов папаина [1981] и термолизина [1982].
Еще один пример корреляции структуры субстратов и их реакционноспособ-ности - это гидролиз пептидов карбоксипептидазой А. Для серий субстратов ZX-Phe и ZGly-X, где X - варьируемый аминокислотный остаток, была обнаружена [1738] линейная зависимость lgKm от гидрофобности боковой цепи остатка X (рис. 59,а). Однако каталитическая константа №cat) для этих веществ практически не зависит от гидрофобной боковой цепи (рис.59,6).
Рис.59. Зависимости констант связывания (а) и каталитических констант гид-
2+ J3+
ролиза (б) субстратов ZGlyGlyX в реакции с Zn (1) и Со (2) карбоксипептидазой А от констант гидрофобности Ганча [1738]
Заместитель (X): Gly (I); Ala (IX); Nva (III); Ъеи (IV); Nle ;v); Phe (VI); Val (VII)
Зависимость величины *са1/ят от размеров боковой цепи п-нитрофенилкарбо-ксилатов была исследована также на примере эластазы [1983]. Она оказывается очень сходной с зависимостью, наблюдаемой в случае химотрипсина (см. рис. 58) с той разницей, что максимум ее приходится на эфир масляной кислоты.
Следует остановиться на резонансных эффектах ацильной группы в реакциях ферментативного гидролиза. Резонансный эффект заместителя в общем случае должен снижать реакционную способность производных карбоновых кислот, стабилизируя резонансную форму
R-CH-CH-C-XR1.
Немногочисленные данные по гидролизу химотрипсином производных коричной кислоты показывают, что это действительно наблюдается на стадии деацилиро-вания, но не наблюдается при ацилировании фермента (табл.45).
Таблица 45. Константы щелочного и катализируемого химотрипсином гидролиза производных коричной кислоты [1987]
Субстрат "Г 1 *он« м_1°'1
о О
1 со
Л5
С6Н5-СН=СН-С00Ме 0,028 0,0125 1,19
С ,Н_ 0Но-0Но СООМе 0,02 0,18 7,7
О О с: с.
Ацилферменты, содержащие ненасыщенные ацильные группы, заметно отличаются по спектральным свойствам от соответств^ кшщх модельных соединений - наблюдается значительный сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область [1984-1986].
Влияние щижиитогрупш. Изменение характера ациламиногруппы в субстратах химогрппсина типа
Н
R-i-COX
JlHCOR1
также сказывается на наблюдаемых величинах кинетических констант. Удаление всей этой группировки приводит к снижению как величины й2, так и величины &3> тогда как значения Кд практически не изменяются.
