Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
4.3.2.2. Корреляции типа линейных зависимостей свободных энергий
Рассмотренные выше корреляции имеют тот недостаток, что они не оперируют с какими-либо параметрами, хауакте ризующими физико-химические свойства субстратов. Вместе с тем очевидно, что именно последние определяют способность субстрата к взаимодействию с ферментом.
Корреляции типа линейных соотношений свободных энергий для ферментативного гидролиза были получены для ограниченного числа субстратов некоторых протеаз. Наиболее подробно в этом отношении изучены сложные эфиры ацилами-нокислот - субстраты а-химотрипсина, трипсина и некоторых других ферментов [1962-19641.
Влияние структуры боковой цепи. Мз данных, приведенных е табл.43, можно видеть, что при увеличении размера боковой цепи константа скорости второго порядка (fe2/Ks) катализируемого химотрипсином гидролиза возрастает, хотя и имеются отдельные исключения (производные валина, изолейцина и отчасти
Таблица 43. Кинетические константы катализируемого а-химотрипсином гидролиза эфиров N-ацетиламинокислот (pH 7,8; 25°С; 0,1 М КС1) [1723]*
Номер Субстрат I k3, с'1 К -103, М ft_2, м К/К , М“1с“1
О S 2 s
дГ
1 AcGlyOMe 0,109 0,298 702 0,15 0,155
2 AcAlaOMe 2,27 5,67 1270 7,6 0,018
3 AcButOMe 8,81 1 ,68 417 3,1 21 ,1
4 AcValOMe 0,98 0,21 500 0,15 1 ,96
5 AcNvlOMe 55,8 9,3 100 14,3 558
6 AcNleOMe 103 19,1 34,4 34,4 2990
7 AcIleOMe 1 ,0 0,18 100 0,09 10
8 AcPheOMe 796 111 7,63 207 1 ,04•105
9 AcTyrOEt 5000 200 17,2 67 2,9-Ю5
10 AcTrpOMe* * 730 29 2,52 2,9 • 105
*Константы обозначены в соответствии с кинетической схемой (30).
**pH 7,0; 25°С 3,17% CH3CN [1761] •
12. В.К. Антонов
Рис.57. Зависимость константы скорости 2-го порядка реакции химотрипсина с метиловыми эфирами N-ацетиламинокислот от гидрофобности боковой цепи
субстрата (pH 7,8; 25°С) [1965]
триптофана). очевидно, что скорость гидролиза в этой серии субстратов коррелирует с гидрофобнили свойствами боковых цепей (рис.57), однако стери-ческие фактору играют определенную роль как в связывании, так и в катализе.
Наблюдается также линейная корреляция между тдцрофобностью боковых целей субстратов и константами скоростей ацилирования и деацилирования химотрипсина [1965„1966].
Стерические эффекты боковой цепи проявляются в константах скорости ацилирования [1967,1968] и деацилирования [19691 а-химотрипсина эфирами алифатических кислот, причем наклон графиков зависимостей &2/Ks и &3 от Es примерно равен единице. Аналогичные зависимости были получены в работах [1726, 1970-1974]. Наряду с индексом гидрофобности было предложено [19751 использовать значение молекулярной рефракции.
Если не учитывать стерические эффекты, то для Метиловых эфиров N-ацетиламинокислот можно написать корреляционное уравнение [1723]:
lgЬг/Кв = (2,2±0,1 )7С - 0,9±0,05. (48)
Это уравнение показывает, что специфичность в этом ряду субстратов зависит исключительно от гидрофобности боковой цепи. Иное положение наблюдается для субстратов с короткой или разветвленной боковой цепью, например для нитрофениловых эфиров алифатических карбоновых кислот В этом случае гидро-фобность заместителя проявляется слабо и основной вклад в скорость ацилирования фермента вносят индукционные и стерические эффекты [1964,19721:
lgft2/Ks=(2,18±0,17)o* + (0,53±0,1)Es + (3,46+0,17). (49)
Следует отметить также, что для ферментативного катализа в отличие от неферментативного корреляционные уравнения требуют введения так называемого параметра специфичности, характеризующего соответствие субстрата и активно-
lgH3-2,Z96*-0,7ZEs
РИС.58. Зависимость констант скоростей деацши' ¦ рования ацилхимотрипси-нов - производных алифатических карбоновых кислот - от констант гидрофобности Ганча для апо-лярных фрагментов ацильной группы; ьзято из:
1- [1976]; 2- [1969];
3- [1972]
о 7 А? aJ
снз(сн2Ь
сн3(сн2)4 СН3(СН2)3
сн3(снг)б
(сн3)2сн, , .
СН3СН2о дусгснз(сн)2 лАСН3ОСН2 Д ал1СН2, .
Н СНэф С1СН2_ . А ?(сн3)2снсн2
СНз
о
С|(снг)2(сн3)3с п(сн3)3ссн2
l4\aJKm
го центра фермента [19761. Для химотрипсинового гидролиза сложных эфиров таким параметром является величина %. Это можно продемонстрировать на примере зависимости константы скорости деацилирования n-нитрофениловых эфиров алифатические (и арилалифатических) кислот от индукционных, стерических и гидрофобных эффектов (рис.58). В координатах lg&3-2,29a*-0,72Es от % получается зависимость, проходящая черве максимум, указывающий на ограничен ность размеров активного центра. В целом, зависимость характеризуется тремя участками: а) участком, не зависящем от гидрофобности алкильной цепи, что характерно для субстратов с короткой или разветвленной ацильной группой; для этих субстратов скорость деацилирования определяется индукционными и стерическими эффектами; б) участком линейний зависимости с наклоном около единицы для неразветвленных субстратов с числом метиленовых звеньев, равным или большие трех, где скорость зависит от гидрофобности заместителя; 6) участком с отпицательным наклоном для субстратов с числом СН2-групп, большим шести, где проявляется ограниченность длины связывающего субстрат участка активного центра.
