Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Внутриклеточный нелизосомальный протеолиз происходит с участием АТР-уби-китин зависимой системы протеолиза [1910,1912]. В эту систему входит небольшой белок убикитин (9 кДа) и несколько ферментов, катализирующих присоединение убикитина его С-концевым глицином к е-аминогруппе гидролизуемого белка, расщепление белка в образовавшемся конъюгате и регенерацию убикитина. Эта система гидролизует преимущественно аномальные клеточные белки [1946,1947]. Предполагается, что узнавание аномальных белков связано с состоянием их N-концевой аминогруппы. Ацетилирование этой группы препятствует гидролизу белка убикитинзависимой системой протеолиза [1948]. кроме этой системы в клетке, по-видимому, функционирует АТР-зависимая, но убикитинне-зависимая система протеолиза с участием высокомолекулярных протеиназ - про-теосом [1949].
Имеется много примеров влияния четвертичной структуры белка на его устойчивость к протеолизу. Так, дрожжевая гексокиназа устойчива в виде димера к протеолизу дрожжевыми протеазами, но при диссоциации димера образующиеся мономеры легко отщепляют фрагмент, важный для димеризации [1950]. Аналогичное явление наблюдается у фосфорилазы А при действии трипсина и глюкозы, когда тетрамерный белок диссоциирует на димеры [1951]. Еще один пример проявления четвертичной специфичности протеаз - действие трипсина на тетрамер (а2рг) триптофансинтазы [1952]. Оказалось, что р-субъединицы не подвергаются расщеплению в тетрамере, но если подвергнуть фермент диссоциации, то они расщепляются трипсином. а-Субъединицы ступенчато расщепляются ферментом так, что они теряют активность. В составе полного фермента реализуется лишь первая ступень гидролиза без потери активности триптофансинтазы. Таким образом,.четвертичная структура белка-субстрата может в значительной степени изменить ход гидролтгического расщепления за счет маскирования определенных мест протеолиза или за счет конформационных изменений в этих по -ложениях.
4.3.2. Количественные зависимости структуры субстратов и их рсашгюнной способности
Рассмотренные выше данные не выходят за рамки качественных закономерностей, не позьшшющих делать какие-либо предсказания в отношении реакционной способности субстратов в реакциях ферментативного гитро.тшза. Ниже мы рассмотрю.: возможности количественного анализа специфичности.
4.3.2.1. Статистический анализ специфдчлости
один из методов количественного ан; лиза специфичности протеолитических ферментов заключается в статистическом анализе частоты расщепления различных пептидных связей в пептидах и белках [1953-1956]. Соответствующие исходные данные можно найти в работах по структурному анализу последовательности аминокислот в белках (см., напрго.:ер: [11973).
Метод заключается в подсчете частоты встречаемости каждой аминокислоты в каждом положении гидролизуемой последовательн зсти и анализе достоверности наблюдаемых отклонений от случайного распределения. В качестве примера приведем расчет специфичности свиного пепсина [19553 по отношению к остатку Не в положении Р_.
N-
- Р,
р!
Общее число исследованных пепдуюв
Общее число остатков Не
Число остатков Не в положение Р.
500
372
3
Частота встречаемости Не в положении Р : А. Т1 = (3/372)100
¦ 20
0,81.
Средняя частота встречаемости Не в положении Р : А = 2 А ,/20 = 4,99,
о
где А1 - частота встречаемости саждой из 20 аминокислот в положении Р1. Отклонение от случайного распределения: К1 11е=0,81/4,99=0,16. Граница доверительного интервала лх^ео, где е=2 (для а=0,95) и o«Sn - среднеквадратичное отклонение К{^ от единицы; д%1=-0,84. Индекс специфичности S1 Ile = -(1-дХ, )/к1 iIle = -5,25.
В результате расчета можно получить "индексы специфичности" (S..), ха-
IJ
рактеризующие предпочтительность (S..^+1), нежелательность (S..^-1) и ин-дифферентность (+1>S..>-1) фермента к данной аминокислоте в данном положе-нии гидролизуемой последовательности.
Для субстратов пепсина индексы специфичности для положения Р1 наиболее и наименее предпочтительных остатков составляют: Leu +2,46, Phe +2,28, Тгр 1,67, Glu +1,49, Ile -5,25, Arg -6,23.
Анализ индексов специфичности поззоляет сделать ряд интересных выводов. Во-первых, в положении PJ наблюдается корреляция индексов специфичности с гидрофобностью боковых цепе! (см. разд.1.4), тогда как в положении Р1 и других такая корреляция отсутствует. Во-вторых, в положении Р1 крайне нежелательны изолейцин, положительно заряженные аминокислотные остатки и Pro
Рис.55. Зависимость среднего
индекса специфичности (S^)
пепсина от положения аминокислотных остатков относит' льно расщепляемой связи [1955]
