Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
R=H или CHq , FA = фуроилакршгоил на аланин делает субстрат нечувствительным к гидролизу. Анализ ЯМР-спектров этих веществ и модели фермента позволили предположить, что в продуктивной конформации комплекса Михаэльса метильная группа аланинового остатка наталкивается на атом серы.
Наконец, следует отметить, что вторичная опецифлчно^ть может сильно меняться в зависимости от вида организма. Так, ренин человека эффективно гидролизует ангиотензиноген и человека и собаки, тогда как ренин собаки не расщепляет ангиотензиноген человека [1800,1886]. Это проявляется и на уровне пептидных субстратов, моделирующих N-концевую последовательность ангио-тензиногенов.
4.3.1.5 Третичная и четвертичная специфичность.
При анализе расщепления белков протеолитическими ферментами возникает новая проблема, связанная с пространственной структурой субстратов. Этой проблеме посвящены-многочисленные обзоры [1909-19131. Известно, что нативные белки, как правило, значительно более устойчивы к протеолизу, чем денатурированные (см., ньлриметэ: [1909, гл.5]). Это привело Линдерстрем-Ланга еще в 1952 г. к теории, согласно которой протеолиз нативных белков идет через стадию их денатурации [1914], причем сама протеиназа может способствовать денатурации, т.е. выступать как денатураза. Процесс может идти в зависимости от отношения скоростей демаскирования пептидной связи (&d) и ее гидролиза (&^) по "последовательному" или "параллельному" (zipper) механизму
(й^&ь.) - Тип механизма может зависеть от природы субстрата, протеиназы и условий реакции, в частности концентрации продуктов гидролиза [1915]. Эти представления согласуются с множеством экспериментальных фактов и на их основе были разработаны методы измерения скорости разворачивания белков. Оказалось [1916], что скорости разворачивания лизоцима и РНКазы, измеренные по скорости протеолиза разными ферментами, совпадают межд, собой и со скоростью денатурации, измеренной независимым методом. В пользу таких представлений говорят также факты значительно большей чувствительности к протеолизу апоферментов, чем холоферментов [1917,1918].
Н S
R
Ог'г ниченный протеолиз
Вместе с тем известны, и все более «ложатся, случаи протеолиза нативных белков, в основном, случаи так называемого ограниченнеео протеолиза [1909, 1919], или процессинга. Сюда относятся давно известные процессы активации зимогенов (см. гл.5), образования биологически активных пептидных гормонов, процессы экспорта белков из клетки и др.
Точки ограниченного протеолиза определяются, во-первых, первичной и вторичной специфичностью гидролизующего фермента. Так, например, энтеропептидаза, имеющая трипсиноподобную специфичность, расщепляет связь, образованную карбоксильной группой лизина в последовательности AspAspAspAspLys трип-синогенов [1920,19211. Процессинг предшественников пептидных гормонов часто идет путем расщепления связи двух остатков основных аминокислот или связи, образованной одним из этих двух остатков с другой аминокислотой [1815, 19221- Очень часто вблизи основного остатка имеется остаток пролина, создающий, по-видимому, особую конформацию расщепляемого участка [1816,1923]. Локальная конформац,;,; расщепляемого участка - это второй важный фактор ограниченного протеолиза. Было показано, что обычно расщеплению подвергаются связи, расположенные в подвижных петлях белковых молекул или участках, соединяющих компактные субглобулы - домены [1917]. Так, например, пепсин подвергается расщеплению внешними протеазами и автокаталитически в области участка цепи, соединяющего два домена с отщеплением 46-членного С-концевого полипептида [1924]. Часто сайты процессинга расположены в "омега-петлях" -участках из 6-16 остатков свернутых так, что рассто. ше между их N- и С
о
концевыми остатками не превышает 10 А [19131-
Анализ большого числа структур гредшественников пептидных гормонов показал, что место процессинга расположено в области с высокой вероятностью образования р-кгшльки и по соседству с высокоупорядоченными вторичными струк турами [19251. Наличие вторичной структуры важно для расщепления не только белков, но и относительно коротких пептидов [19261. Наконец, еще два фактора, важных для протеол::за нативных белков, - это доступность гидролизуемой связи и подвижность расщепляемого участка [1927-19301. Оба эти фактора могут быть смоделированы из данных рентгеноструктурного анализа или устгнов-лены экспериментально на основании значений температурного В-фактора в кристалле [19281, причем наблюдается хорошее совпадение предсказанных и экспериментально установленных мест протеолиза. Несомненно, что только реализация всех указанных условий приведет к эффективному расщеплению белка в нужном для функционирования месте.
Ограниченный протеолиз был подробно исследован в количественном аспекте на примере расщепления аео-казеина и других казеинов химозином и родственными протеиназамл [1931-19371. Было показано,что расщепление связи Phe-Met в пептиде:
I
