Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
(24)
Отсюда следует, что величины экспериментально определяемых кинетических констант будут:
К К
2 s
Таким образом, обе константы будут уменьшаться на одинаковую величину, и это изменение будет проявляться тем сильнее, чем больше соотношшие констант К /К'. Очевидно, что величина к /К' не изменяется при непродуктивном
В G СЗХ ГО
связывании и остается равной кг/Кв. Характерным признаком непродуктивного связывания в серии однотипных суостратов является симбатное изменение & t и при постоянном их отношении. В качестве примера можно привести данные по кинетике гидролиза сложных )фиров и амидов отли ше от амидов в ряду эфиров наблюдается [1719] -
а-химотрипсина (рис.48). В непродуктивное связывание
Рис.48. Зависимость к^ от Кв ряду
амидных (I) и эфирных (II) субстратов а-химотрипсина [1719]
1- 4-PyTyrNH2; 2- 3-PyTyrNH2;
3-
ClCH2C0TyrNH2; 4-
CP3C0TyrNH2;
5- CH3TyrNH2; 6- CinnTyrOEt;
7- АсЬеиТутОМе; 8— BzTyrOMe
(Ру - пиридиноил, Cinn - циннамоил)
В кинетической схеме с несколькими промежуточными фермент-субстратными комплексами (см. схему 5, разд.4.1.1) может реализоваться несколько иной тип непродуктивного связывания, а именно изомеризация первого комплекса в непродуктивный (ES'):
К
Е + S
ES
Е S
Е + Р.
(27)
-2
ES'
В этом случае наблюдаемые кинетические параметры будут [1715]
зКт
К
cat
к„
К’ =
т
V(1+As}
где Кр
к_г+к3
К' = [ES']/[ES3.
Как и в первом случае, непродуктивное связывание здесь не влияет на отношение кинетических констант. Наконец, для обратимых реакций
Е + S =е-
Е + Р
-2
в условиях, когда кг«к_^ , значение Кт в направлении образования субстрата равно К =к л/к т.е. вообще никакого отношения к связыванию продукта не
го.Р —1 —с.
имеет (так называемая кинетическая константа Ван-Слайка) [1720].
4.1.5. Определение индивидуальных кинетических констант
Как показывают изложенные выше данные, анализ кинетики ферментативного гидролиза на основе величин &cat и К^ может дать лишь ограниченную информацию
о скоростях отдельных стадий и устойчивости промежуточных комплексов. Поэтому большое значение приобретает определение постадийных констант скорости и равновесия. С этой целью применяются как методы стационарной кинетики, так и методы исследования процесса на предстационарной стадии.
4.1.5.1. Стационарные методы
Здесь мы остановимся на трех методах, применяемых при исследовании гидролитических реакций.
Первый из них заключается в том, что подбирают два (или больше) субстрата так, чтобы стадии, лимитирующие скорость, для них были различны, но константы скорости одной иэ стадий одинаковы. Например, если взять в качестве субстратов а-химотрипсина п-нитрофениловый эфир и амид Л-ацетил-Х-фенилала-нина, то в первом случае лимитирующей стадией будет распад промежуточного ацилфермента, а во втором -его образование [1721]:
*2 *3
Е + S ==—* ES -------> ЕА (+Р1 ) -----> Е + Р2- (28)
I. AcPhe0C6H4N02, ;
II. AcPheNH2, й2"*з -
Поскольку оба субстрата имеют одинаковую ацильную группу и отличаются только характером отщепляемого продукта Р , то значения &3 для них должны быть одинаковыми. Поэтому, чтобы определить для субстрата II, достаточно получить &cat=&3 для субстрата I. Для всех соединений - производных ацетил- Ь-фенилаланина величину k2 можно найти из соотношения:
к.
3 cat
2
3 cat
Аналогично можно найти К =К'(k +k )/Ь . Этот метод, однако, имеет огра-
?5 m do о
ниченное применение, так как могут возникнуть осложнения из-за непродуктивного связывания и, кроме того, при близких значениях &3 и &cat он дает очень большую ошибку.
Второй метод заключается в использовании эффектора, влияющего только на одну стадию процесса. Пусть, например, имеется вещество, введение которого в систему влияет только на величину &2 (см. схему 28). В присутствии этого вещества кинетика гидролиза описывается уравнением:
[Е] IS]
v* =-------------------------. (29)
+ [S ]
Решая совместно уравнения (8) (в предположении, что &2«й_1) и (29), мож-
Рис.49. Определение индивидуальных кинетических констант с помощью введенного нуклеофила [1723]
