Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
4.1.2. Методы определения кинетических параметров
Чтобы получить численные значения кинетических параметров, входящих в уравнения, приведенные в разд. 4.1.1, необходимо определить начальные скорости превращения субстрата в зависимости от его концентрации. Анализ этих зависимостей чаще всего проводится графически путем преобразования уравнений скорости в линейную форму. Так, по методу Лайнуивера-Берка [1672] линейным преобразованием уравнения (2) будет
11 К 1
II ml
- =------+-------------. (16)
v к ДЕ] к ДЕ] [S]
cat о cat о о
Строя зависимости 1/и от 1/ES3о, получают графики типа, представленного
Рис.44. Оггределение кинетических параметров ферментативных реакций по методу Лайнуивера-Берка (а) [1672] и Иди-Хофсти (б) [1673]
Рис.45. Определение кинетических параметров двухсубстратных ферментативных реакций а - первичные и 6,6 - вторичные графики
на рис.44,а. Точки пересечения прямой с осями координат дают значения k . ЕЕ] и К .
cat о ш
Другой способ линеаризации уравнений типа (2) предложен Иди и Хофсти [1673] (рис.44,(3):
V
Я_-----• (17)
V = Ь ДЕ]
cat с
3[S]
Оценка точности определяемых значений кинетических параметров в этих и других типах линейных представлений уравнения Михаэлиса-Ментен дана в И 674-1677].
Анализ двухсубстратных реакций проводится обычно путем измерения скорое-
10. В.К. Антонов
ти в зависимости от концентрации одного из субстратов при фиксированных концентрациях второго субстрата. Вид графиков в двойных обратных величинах (рис.45) позволяет во многих случаях отличить упорядоченный механизм от неупорядоченного, а из вторичных зависимостей величин отсекаемых отрезков от концентрации второго субстрата - получить значения кинетических констант двухсубстратной реакции.
Практические методы измерения начальных скоростей реакций и анализа кинетических уравнений приведены во многих руководствах [1613,1659].
В результате такого анализа получают значение кажущейся конгтадты Михаэ-лиса, смысл которой зависит от типа кинетического механизма (см. разд. 4.1.3), и максимальную скорость
Уравнение (2) можно представить в интегральной форме:
[Р] Кт tS]o
— = V---------In —----------,
t шах t [S3 -[Р]
О
где [Р] - концентрация продукта в момент времени t. Анализ этого уравнения
[S]o
проводят [1678], строя зависимости [F]/t от 1/t-ln------------------. Получающаяся
[S] -[Р]
о
прямая имеет тангенс угла наклона, равный Кт, и отсекает на оси ординат отрезок, равный Vmax- Предложены интегральные уравнения и для более сложны:: случаев (см., например: [16791), а также ряд способов анализа полной кинетической кривой ферментативной реакции [1680,1681].
Определение активности амидгидролаз. Титрование ан^чвмиг центров. Чтобы из значений максимальной скоро см получить величину й t. необходимо знать концентрацию активных центров фермента. Это последнее значение опрьдьлить не всегда просто, и оно известно лишь для ограниченного числа амидгидролаз.
Для определения абсолютной концентрации активных центров ферментов прэд-ложено несколько методов [1402]. Одна группа методов основана на применении необратимых (или квазинеобратимых) ингибиторов, селективно реагирующих с активными центрами исследуемого фермента. Если ингибитор содержит хромогенную или радиоактивную метку, то, отделив модифицированный белок и определив содержание метки, можно рассчитать концентрацию активных центров при условии, что известна молекулярная масса белка. Недостатком этого метода является- необходимость иметь строго селективный ингибитор, реагирующий с белком количественно. Убедиться в этом можно, только получив предварительно белок в чистом виде и исследовав реакцию модификации. Такие необратимые ингибиторы описаны в гл.5. Предложено также использовать некоторые прочно связывающиеся обратимые ингибиторы, например n-аминобензамидин для титрования трипсина И ТрОМбИНа [1682].
Если указанные выше условия выполняются и известно число активных центров в молекуле фермента, то определить абсолютную концентрацию фермента можно, не прибегая к меченым ингибиторам и выделению модифицированного белка. Используя концентрации ингибитора заведомо меньшие, чем концентрация фермента, и определяя остаточную активность фермента, можно найти искомое значение его концентрации (рис.46).
Другой способ титрования активных центров, применяемый в тех случаях, когда реакция идет ступенчато с накоплением промежуточного соединения, зак-
Рис.46. Титрование активного центра фермента
Зависимость активности (4) от молярного соотношения ингибитора и фермента
лючается в измерении первоначального "выброса" продукта на предстационарной стадии [1208,16831. Представим себе, что реакция фермента с субстратом приводит к быстрому образованию первою продукта (Р1) и медленному распаду промежуточного комплекса (ES') с образованием второго продукта (Pg>):
