Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
3.5. Заключение
Отмеченные ранее особенности электронной структуры амидной группы - стабильность и чувствительность к внешним воздействиям - определяют низкие скорости некатализируемого расщепления амидов и существование многочисленных типов катализа, заметно облегчающих реакцию гидролиза. Важнейшим и наиболее энергоемким процессом является резонансная дестабилизация амида, т.е. воздействия, направленные на снижение порядка связи 0-N. Это достигается или протонированием карбонильной группы (кислотный катализ), или повышением заряда на атакующей карбонильный углерод молекуле (основной катализ), а также способностью амидной группы к внеплоскостной деформации без больших энергетических затрат. Сам акт нуклеофильной атаки, по-видимому, является согласованным процессом в том смысле, что чем сильнее отрицательно заряжен ная группа приближается к карбонильному углероду, тем эффективнее происхс дит перераспределение электронной плотности, уменьшающее резонансную стаби -лизацию. Атака нуклеофила завершается, как правило, образованием неустойчи вого тетраэдрического промежуточного соединения, направление распада кото рога определяется как его конформацией, так и свойствами связанных с тетраэдрическим углеродом заместителей. На этой стадии распад в направлении продуктов ускоряется по типу общего кислотно-основного катализа. Катализ особенно эффективен, если он происходит внутримолекулярно. При этом важное значение имеет взаимное расположение реагирующих атомов. В наиболее благоприятных случаях наблюдаемая величина ускорения близка той, которая достигается при ферментативном катализе.
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ. ФЕНОМЕНОЛОГИЯ
Две особенности отличают ферменты от небиологических катализаторов - эффективность и специфичность. Хотя в моделировании биокатализа достигнуты заметные успехи, все же в полной мере воспроизвести эти особенности ферментов на моделях до сих пор не удалось. В этой главе будет приведен основной фактический материал, касающийся эффективности и специфичности амидгидролаз.
4.1. Ферментативная кинетика
Как и всякий катализатор, фермент может проявлять свое действие в концентрациях, существенно более низких, чем концентрация субстрата. В этих условиях можно различить три фазы реакции: 1) предстационарную, когда концентрация свободного фермента резко падает (обычно до нуля при [S]o»[E]q); 2) стационарную, когда скорость реакции почти не меняется во времени; 3) пост-стационарную, когда скорость реакции убывает во времени из-за значительного снижения концентрации субстрата (см. обзоры: [1613,1655-1661].
4.1.1. Стационарная кинетика
Обычно скорость ферментативной реакции измеряют на стационарной стадии. При этом концентрация субстрата и всех промежуточных продуктов изменяется пренебрежимо мало по сравнению с начальной концентрацией. Условие стационарности выполняется при степени превращения субстрата, не превышающем 10-15% (рис.43).
Если увеличить начальную концентрацию субстрата, то в отличие от неферментативных реакций скорость процесса в конечном счете достигает постоянной величины и далее уже не зависит от концентрации субстрата. При этом достигается насыщение фермента субстратом и скорость реакции становится максимальной. Явление насыщения указывает на то, что фермент и субстрат образуют комплекс, и этот последний претерпевает химическое превращение:
Образование фермент-субстратного комплекса является обратимым процессом, причем реагенты удерживаются в нем силами нековалентной приро ды. Существует множество физико-химических и прямых рентгеноструктурных данных, подтверадаю-
Рис.43. Зависимость концентрации цродукта ферментативной реакции от времени 1 - предстационарная стадия; г - стационарная стадия; 3 - постстационарная стадия
щих образование таких комплексов (см. гл.6).
Выражение для скорости превращения субстрата, соответствующее схеме (1), хорошо известно как уравнение Михаэлиса-Ментен [1662]:
dP VE]o[S]o
— = V = -------------, (2)
at К +[S]
m о
где называют константой Михаэлиса. При выводе этого уравнения
предполагается, что распад комплекса ES в направлении исходного субстрата происходит во много раз быстрее, чем его химическая трансформация, т.е. k_1»&2. Если не веодить это допущениз, то, как показали Бриггс и Холден [1663], значение Km=№ 1+ft2)/fe1. В более сложных случаях выражение для Кт становится еще более сложным. Поэтому предложено [1664,1665] обозначать константу диссоциации фермент-субстратногс комплекса как субстратную константу йа=й_1/й1, а во всех остальных случаях величину, входящую в знаменатель уравнения (2), называть константой МихаЕлиса и обозначать как Ат или iT, где знак "прим" указывает на эксперимонтальное (кажущееся) значение. Величина константы скорости химического превращения также может быть сложной величиной. Обычно ее называют каталитической константой (ft .), она
cat
