Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Конечно, не кяждый субстрат, образуя . продуктивный комплекс, реализует
О
степень пирамидализации порядка 0,2 А. То же относится и к субстрату, обра-
эующему комплекс с разными ферментами. Задача заключается в том, чтобы установить степень оптимального нарушения резонансной стабилизации для разных фермент-субстратных комплексов.
Попробуем оценить другие параметры, определяющие эффективность катализа в нашей модели. Значение Кз легко определяется из данных стационарной кинетики, если справедливо равенство iT=Ke- В рамках модели это условие реализуется, когда Кр<1 и KnKQ<1, т.е. равновесие сдвинуто в сторону сорбционного, а не фиксированного комплекса. Равенство для серии однотипных субстратов отражает, вероятно, то обстоятельство, что при образовании сорбционного комплекса с ферментом взаимодействует один и тот же одинаковый или очень сходный фрагмент субстрата. До тех пор пока в этой серии значение К не превысит единицу, специфичность будет проявляться лишь в максимальных скоростях. После этого должна наблюдаться тенденция к "насыщению" кинетической специфичности (&cat»const) и будет проявляться специфичность по связыванию. Эти выводы находят экспериментальное подтверждение в анализе зависимостей &cat от для ряда амидгидролаз (см. рис.67).
Оценить значение Кр значительно труднее. Изменение свободной энергии на этой стадии определяется эффективностью вторичных взаимодействий, которые должны компенсировать потерю системой вращательных степеней свободы. Экспериментальные значения, полученные в опытах остановленного потока или температурного скачка (см. разд.6.2.3), возможно, характеризуют кажущееся значение Кр, включающее свободную энергию стабилизации реагирующего фрагмента молекулы. Эти значения для многих исследованных соединений невелики и лежат в области Кр=5-20 (см. табл.68). Лишь для пента- и гексапешлдсз - субстратов папаина значение константы равновесия второго комплекса составляет 120-250, что соответствует изменению свободной энергии на 2,8-3,3 ккал на моль. Однако тот факт, что многие ингибиторы, как белковые, так и "аналоги переходного состояния", имеют константы ассоциации порядка 1•1010 М-1, показывает, что общая величина изменения свободной энергии комплексообразова-ния может быть значительно выше.
Теоретическая оценка минимальной величины Кр может быть сделана из предположения о строении комплекса EQSn и числа вращательных степеней свободы, которые система теряет при образовании комплекса Е s^. Например если предположить, что в комплексе Е s субстрат AcPheAlaNH2 взаимодействует с химотрипсином только своей ароматической группой, то переход в комплекс EpSn должен сопровождаться замораживанием свободного вращения вокруг 9 о-связей. Это приведет к потере энтропии около 45 э.е. [2453], т. е. порядка 13 ккал на моль. Эта величина частично компенсируется увеличением энтропии за счет сольватации и должна полностью компенсироваться за счет образования связей с ферментом. Такие оценки, конечно, крайне приблизительны, но в принципе расчет величин Кр вполне реален.
Величина энергии стабилизации активной формы субстрата может быть получена из формулы (35), если известны значения К и К и отношение констант
р 3
скоростей второго порядка для ферментативной и неферментативной реакций. Если это отношение составляет Ю10 (см. табл.50), а величина К »1 • 1 СГ4 М,
г ®
то даже при Кр=1 величина KQ=10, что соответствует изменению свободной энергии на 13,5 ккал/моль.. Такая величина представляется мне вполне разумной.
Какова константа скорости собственно химического превращения субстрата №5)? Тот факт, что амидгидролазы способны превращать субстраты со скоростями, б-шзкими к диффузионно-контролируемым, свидетельствует о том, что эта константа может быть сравнима с константами скоростей таких реакций (Ю8-Ю9 с-1). Таким образом, допущение, принятое выше, о быстром установлении равновесия в схеме (29) вряд ли оправдывается, и на самом деле лимитирующей стадией является одна из нехимических стадий (см. также: [1716]).
ч В этом случае определяемые из pH-зависимости скорости реакции значения р#а функциональных групп фермента имеют смысл кинетических рК& (см. разд. 5.2.2). Возможно, что именно с этим обстоятельством связана довольно часто наблюдающаяся зависимость значений рКа груш свободного фермента от типа используемого для определения субстрата.
В рамках предлагаемой модели непродуктивное связывание должно преимущественно происходить на стадии образования фиксированного комплекса фермента с неактивной (EpSn) или активной (EpSa) формами субстрата. При этом соответствующая величина константы равновесия (Кп или Кр) будет изменяться на величину K{=[EpS']/[E s], где Eps' - непродуктивный комплекс, т. е. на величину K'=Kp+Ki, причем эти изменения будут одинаковым образом сказываться на величинах fecat и iT, но не будут влиять на их отношение.
