Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Такой механизм в отличие от рассмотренных выше объясняет изменение константы скорости второго порядка как в ряду субстратов (специфичность), так и по отношению к конгруэнтной модели (эффективность).
Этот же результат можно получить из теории напряжений, если предположить, что напряжения, возникающие в основном состоянии, снимаются по достижении системой переходного состояния.
Концепция стабилизации переходного состояния подкрепляется следующими аргументами: 1) оценки полной энергии фермент-субстратного взаимодействия обычно значительно превышают наблюдаемые (в Кд) изменения свободной энергии комплексообразования; 2) имеется много примеров, когда в серии субстратов изменяется каталитическая константа при практически постоянном значении Кд (см. разд.4.3.4). Наиболее характерным примером может служить катализируемый пепсином гидролиз пептидов, когда при переходе от ди- к тетрапептидам Кт (равная в данном случае Кд) изменяется не более, чем в 10 раз, a fecat увеличивается в 105 раз; 3) направленный мутагенез групп, участвующих в связывании субстрата, часто влияет не на связывание (Кд), а на катализ (*oat)- Особенно подробно такие работы проведены на примере тирозил-тРНК синтетазы [1613,3409-3411]; 4) так называемые аналоги переходного состояния (см. разд.5.9.7) имеют, как правило, аномально низкие значения ?(. Однако, как уже указывалось, трактовка этого факта не является однозначной.
Применительно к катализу химотрипсином и некоторыми другими протеазами эти идеи были воплощены в виде экстракцлонно-конформационной модели их действия (см. обзор: [19631).
Экспериментальный факт, лежащий в основе этой модели, заключается в том, что для субстратов химотрипсина - эфиров W-ациламинокислот - изменение свободной энергии на стадиях ацилирования (&g|) и деацилирования (&G*) фермента соответствует изменению свободной энергии при переносе боковой цепи субстрата из воды в неполярное окр^жоние (дG^ ):
LG* = дG* » дС^.. (24)
В то же время в бимолекулярном процессе из исходных реагентов (kcat/K ) наблюдается соотношение:
< и ZaGL- (25)
Это последнее соотношение показывает, что энергия гидрофобного взаимодействия используется как для образования комплекса фермента с субстратом, так и для понижения активационного барьера химической стадии, что и предс казывает теория стабилизации переходного состояния.
Объяснение этого эффекта заключается в том, что в переходном состоянии вследствие конформационных изменений возникают добавочные гидрофобные взаимодействия, отсутствовавшие в основном состоянии фермент-субстратного комплекса (рис.132) [3350,34121.
Кроме гидрофобных взаимодействий в стабилизации переходного состояния могут участвовать все те взаимодействия, о которых говорилось в разд.8.2, если только их эффективность в основном и переходном состояниях различается.
В качестве иллюстрации таких взаимодействий можно указать на гидроли --химотрипсином дипептидов AcPheGlyNH^ и -РЬзАХаМЧ, и]. Как ,же уИцзыва
лось вкше (см. рявд.7.1 O'), замейв етома тодорояа на метальную группу (Gly *
Рис.132. Механизм возникновения дополнительных гидрофобных взаимодействий фермента с субстратом при образовании переходного состояния [3350, с.157]
Ala) приводит к резкому увеличению скорости гидролиза, проявляющемуся в feoat, а не в Кт. Анализ рентгеноструктурных моделей фермента показал, что в основном состоянии.комплекса химотрипсина с аланиновым субстратом имеются неблагоприятные взаимодействия метильной группы с некоторыми грушами белка, а при образовании тетраэдрического промежуточного соединения эти взаимодействия отсутствуют. Этот результат можно трактовать как в рамках представлений о стабилизации переходного состояния, так и в рамках теории напряжений, включающей стабилизацию переходного состояния как результат снятия напряжений основного состояния.
Предполагается, что в стабилизации переходного состояния у сериновых протеаз основной вклад вносят водородные связи. Оценка энергии этого вклада дана в работе [34131. Предложены два механизма такой стабилизации: один
[13301 предполагает участие трех Н-связей, образуемых переходным состоянием и отсутствующих в комплексе Михаэлиса. Это связи, образуемые карбонильным 0-атомом с ЫН-грушами Ser195 и Gly193, и связь ациламиногруппы субстрата с карбонилом Ser214. Электростатическое поле, создаваемое ионной парой Asp102-His57, возможно стабилизирует тетраэдрическое переходное состояние у сериновых протеаз [3190,3257]. Другой механизм [2011,34141 предполагает наличие этих связей как в комплексе Михаэлиса, так и в переходном состоянии, и эти связи не вносят вклада в энтальпию активации реакции, однако существенно изменяют энтропию переходного состояния. Были получены экспериментальные подтверждения этого второго механизма [34151.
Теория стабилизации переходного состояния наиболее полно согласуется с экспериментальными данными, но и она встречается с серьезными трудностями.
