Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Как указывалось выше (см. разд.6.2 3), при катализе гидролиза пептидных субстратов карбоксипептидазой А четко прослеживается образование по-крайней мере двух комплексов фермента с субстратом. В случае же эфирных (депсипеп-тидных) субстратов второй комплекс является, скорее всего, комплексом фер-меьта с продуктами гидролиза, т.е. лимитирующей скорость стадией процесса в этом случае является диссоциация продуктов [3242]. По-видимому, в случае металлзависимых амидгидролаз l .разовавшаяся при гидролизе карбоксильная группа субстрата остается в координационной сфере металла и лишь затем вытесняется молекулой воды. Механизм такого отщепления в случае термолизина показан на рис.115 [3316].
Отсутствие ковалентных промежуточных соединений в указанных выше случаях ставит вопрос о механизме ацильного переноса и транспептидации. Сам факт катализа амидгидролазами таких реакций долгое время служил основным аргументом в пользу образования промежуточных ковалентных ацилферментов, а у аспартатных- протеаз - и "аминоферментов" [1749,1750,2173,2177,2178,3342, 3343]. Реакции транспептидации были объектом детально!'о изучения (см. разд.
4.8.1 ).
Если реакции переноса идут из нековалентных комплексов фермент-продукт, то стабильность этих комплексов должна быть достаточно высокая, чтобы обеспечить связывание акцептора транспептидации и образование химической связи между переносимым фрагментом и акцептором. Располагая данными о начальных скоростях транспептидации [1667] и константах диссоциации комплексов фермент-продукт, можно оценить выполнимость этого условия.
Кинетическую схему транспептидации можно представить в виде:
*е *2 *3
Е + S --------» ES-------> ЕР.----------- Е + Р,,
Ч 1 1
Р2
Йд Й5
ЕР. + А «г--------» ЕР.А ---------> Е 4 S'*,
1 J? 1
где S - субстрат; S* - продукт транспептидации; Р1 и Р? - соответственно первый (переносимый) и второй продукт гидролиза; А - акцептор транспептидации.
Отношение скоростей гидролиза и гранзпептидации дается уравнением \ кзк-л 1
V. ЕА]
t 4 о с
Если допустить , что к3**к_л, то можно вычислить константу скорости распада комплекса фермент-продукт (ЕР^):
А
кз = /— ^дополученные результаты для некоторых реакций транспептидации представленч в табл.78. В расчетах принималось значение й4=:1-Ю7 ЬГ1сГ1, а остальные данные бы„ш взяты из работы [16671-
Таблица 78. Константы скорости распада комплекса пепсин-продукт. Акцептор - Phe(NOr)OH; [A]o=0,667 мМ; pH 4,6; 37°С
Субстрат* Vh/Vt 1 *3- 0-1
О
AcPheTyrOH 22,0 5.1 -10~4 8,65
АсТугТугОН 22,2 4,9-Ю-4 8,5
AcPhePheApm 351 7,75-Ю-4 42,5
GlyGlyPhePbi3Ap.Ti 380 8.1 .10~4 45,3
*Apm - 3-(морфолинот тропил )-ам1 1Д.
Данные табл.78 показывают, что константы скорости распада комплекса фермент-продукт, необходимые для обеспечения наблвдаемых скоростей транспептидации, лежат в области 10-50 с-1.
Экспериментально определяемые константы скорости диссоциации комплексов фермент-продукт (или фермент-ингибитор) составляют 1•104—1¦105 с-1, что на три-четыре яорядка выше необходимых для транспептидации. Таким образом, обычный комплекс фермент-продукт не может быть тем комплексом, который участвует в реакции переноса фрагмента субстрата на акцептор.
Это противоречие можно разрешить если предположить, что на пути превращения субстрата в продукт возможно не теыько ступенчатое образование про-
дуктивного фермент-суСстратного комплекса (см. разд.6.2.3), но и ступенчатая диссоциация комплексов фермента с продуктом:
Кв Кр ko KR KQ Kt
Е + S ^-1* EoS EpS —^ ЕрР,Рг ЕрР, ,—- ЕоР, Е + Р,.
+
рг
В этом случае кажущаяся константа диссоциации комплекса ЕрР1 будет:
К.К. [Е Р, ]
I Q о 1
UKQ « [ЕрР,]
Если , то наблюдаемая константа ингибирования продуктом К[=К1ш т.е. характеризует лишь образование комплекса EqP1. Превращение EqP1 в ЕрР1 лимитируется в этом случае низкой константой скорости (к ) в реакции:
к
ЕРР1 ЕоР1‘
-q
Если превращение ЕрР1 в EqP1 идет с константой скорости (к^=к3) порядка 10-50 с-1, то при KQ>1 к_ должна быть меньше указанных величин.
Таким образом, можно предположить, что транспептидация происходит в комплексе ЕрР1, способном связывать акцептор. Образование этого комплекса легко идет из субстрата в ходе его гидролиза. Если же в системе субстрата нет, то образование комплекса ЕрР1 ограничивается низкой скоростью превращения EqP1 в ЕрР. . В этом случае продукт и акцептор могут реагировать, образуя новый пептид в количестве, определяемом константой равновесия всего процесса.
