Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Протонирование серинового гидроксила при распаде образовавшегося тетраэдрического промежуточного соединения может происходить в "постпереходном" состоянии, т.е. сериновый гидроксил, будучи лучшей уходящей группой, чем гидроксильная группа присоединившейся молекулы воды (рКа соответственно 13,5 и 15,5), может уходить в виде аниона и протонироваться имидазолий-катионом His57.
Исследование кинетического изотопного эффекта растворителя в смесях с разным соотношением H?0 и D?0 [2439,3177,3178,3331] дало основание утверждать, что при деацилирования неспецифических ацилхимотрипсинов происходит перенос одного протона 2,5), но деацилирование высокоспецифичных
ацилферментов сопровождается переносом двух протонов. В случае хороших субстратов это было приписано функционированию системы переноса заряда (перенос второго протона между His57 и Asp102); однако более вероятным представляется участие в деацилирования одного из протонов, образующих Н-связь в оксианионной полости (см. также: [2438]).
Ацилирование сериновых протеаз специфическими субстратами повышает "жесткость" белковой молекулы и снижает ее чувствительность к рН-зависимым конформационным переходам [3332]. Основную роль здесь играют боковые цепи остатка Р субстрата. Вместе с тем взаимодействие этих боковых цепей с участком их связывания в активном центре (St) приводит к конформационному изменению фермента, способствующему дальнейшему протеканию реакции. Это, в частности, было показано [3333,3334] на серии так называемых обратных субстратов трипсина типа + О
VOV°-i-R-h2n'
Расщепление этих субстратов приводит к образованию ацил^зрментов с неспецифической группой COR, где R=CH3, С2Н5, С3Н7 и др. Добавление к ацил-ферменту аминов заметно увеличивает скорость их деацилирования, причем использование флуоресцентно меченных груш R показало, что конформационное изменение увеличивает доступность ацильной группы воде.
В случае цистеиновых протеаз деацилирование ацилферментов происходит в целом по такому же механизму, как и деацилирование сериновых протеаз. Здесь возможны два основных отличия. Во-первых, рКа остатка His159 в папаине («4,2) заметно ниже, чем рКа his57 в химотрипсине («7), поэтому можно ожидать, что скорость переноса протона от воды на имидазол должна быть почти на три порядка ниже у цистеиновых ферментов по сравнению с сериновыми. Возможно, что это компенсируется большей степенью дестабилизации эфирной группы в тиоэфирах, однако, как это следует из данных резонансных Раман-спект-ров дитиоацилпапаинов [3102,33351, связь С-S скорее укорочена за счет взаимодействия атома серы фермента с атомом азота Р -остатка. Во-вторых, распад тетраэдрического промежуточного соединения в случае цистеиновых ферментов не требует протонирования уходящей группы. Уход группы -CHgS- сразу регенерирует активную форму фермента.
Ацилферменты цистеиновых протеаз существуют в двух конформациях - А и В, причем конформация В доминирует 133361:
S—Е
Две формы, по-видшдажу, существуют и у ацилхимотрипсинов [33371- Динамика ацилферментов сериновых протеаз исследована в работах [3338-33401.
Образующийся в результате деацилирования комплекс фермент-продукт должен диссоциировать с образованием ацильного продукта и регенерацией свободного
фермента. Хотя сродство продуктов гидролиза к ферменту обычно близко к сродству субстратов, это не сказывается на скорости гидролиза вплоть до значительных степеней превращения субстрата, так как концентрация свободно-
Glu 143
Р 115
'N /
о I
¦N-A. VN^ ^-N—1—СО ,H
'х 1 ¦
L *®н г
Ж №
Туг 157
His 231
Рис.115. Механизм катализа термолизином [3316], включающий комплексы ЕР Pg и ЕР1, в которых образовавшаяся карбоксильная группа продукта остается включенной в координационную сферу металла
ES и ЕТ - соответственно комплекс Михаэлиса и тетраэдрическое промежуточное соединение
22. В.К. Антонов
го продукта остается низкой. Однако при высоких концечтрацгшх продуктов скорость будет падать за счет конкурентного торможения продуктом. Не исключено, что, как и ассоциация фермента и субстрата (см. разд.6.2.3), диссоциация комплексов фермент-продукт происходит ступенчато. Этот вопрос будет подробнее рассмотрен ниже. Кроме того, учитывая низкую свободную энергию гидролиза ацилфермента при кислых значениях pH, следует иметь в виду, что в этих условиях деацилирование будет происходить весьма медленно, накопление продукта может приводить к обращению реакции и образованию ацилфермента [2003,33411. Действительно, рентгеноструктурный анализ комплексов протеазы h из Streptomyces grtseus с продуктом показал [3063,3129]. что карбоксильная группа продукта образует Н-связь с имидазолий-катионом His57. Эта связь стабилизирует комплекс и ее разрушение (при нейтральных pH) способствует диссоциации продукта.
Как было показано выше (см. разд. 7.4), пепсин, лейцинаминопептидаза, термолизин и карбоксипептидаза А (амидные субстраты) функционируют по типу общего основного катализа на стадии нуклеофильной атаки карбонильной группы гидролизуемых соединений. При этом, очевидно, исключается образование ацил-ферментов. Что касается гидролиза сложноэфирных субстратов карбоксипептида-зой, то в условиях криоэнзимологического эксперимента были получены данные, которые трактовались как свидетельство промежуточного обра ювани« ацилфермента - ангидрида, образованного карбоксильными группами фермента и субстрата. Эти данные нуждаются, однако, в подтверждении (см. разд.7.4).
