Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
[3322], что объясняется, по-видимому, сольватацией переходного состояния в этой реакции.
Хотя изменение свободной энергии при гидролизе тиоэфиров несколько (на 2-3 ккал/моль) выше, чем кислородных эфиров, скорости их щелочного гидролиза различаются очень мало. Деацилирование неспецифических ацилпапаинов происходит несколько быстрее, чем соответствующих ацилхимотрипсинов, но специфические ацилхимотрипсины гидролизуются заметно быстрее ацилпапаинов
[3323].
Дерцилирование ацилформентов ставит те же проблемы, что и ацилирование, но в более острой форме. Поскольку нуклеофильным агентом в этих случаях является молекула воды, движущей силой эффективного деацилирования может быть или эффективный общий основной катализ, или же дестабилизация эфирной группы в ацилферменте.
Уже на ранних этапах исследования ацилхимотрипсинов были обнаружены [19851 спектральные аномалии хромогенных неспецифических ацилхимотрипсинов, которые моглк свидетельствовать о дисторсии сложноэфирной группы. Это подтвердилось рентгеноструктурными данными [1328] (З-(З-индолил)-акрилоилхимо-трипсина (см. также рис.113):
СН-СН-С-О-Е.
н
Анализ этих данных показывает, что сложноэфирная группа заметно искаже-
о
на: она пирамицализована (дс=0,3 А), а двугранный угсл ш составляет всего лишь -122°.
РИС.113. Стереомодель (3-(3~индолил)-акрилоил-а-химотрипсина [1328]
Исследование резонансных Раман-спектров ряда ацилферментов [3100,3101] показало, что частоты сложноэфирной группы близки частотам альдегидного карбонила. Сходные выводы были получены [3324] при изучении ЯМР-спектров селенсодержащих ацилхимотрипсинов. Наблюдается корреляция между степенью поляризации карбонильной группы в ацилхимотрипсинах и скоростью их деацилирования [33251.
- 04
’ РИС.114. Зависимость заряда на карбонильном
углероде в метилацетате и порядка связи между ' ' этим углеродным атомом и О-атомом атакующей
молекулы воды от степени пирамидализации слозк-' 0,Z новфирной группы (рассчитано С.Л.Александровым методом СГГОО/2)
U J I а
о 0,1 о,г лс, а
Таким образом, по крайней мере у исследованных ацилферментов, а вероятно, и у других эфирная связь резонансно дестабилизирована. Пирамидализация сложноэфирной группы приводит к изменению заряда на карбонильном С-атоме и порядка связи, образующейся между атомом кислорода воды и карбонильным уг-лнродом (рис.114). Величина дс=0,3 близка к величине пирамидальности пол-
& С, эл ев 03S
ностъю тетраэдрического углеродного атома. Возможно, что такая большая величина не реализуется в ходе гидролиза специфических субстратов химотрипсина, тем не менее дестабилизация сложноэфирной связи в ацилферменте может быть одной из причин высоких скоростей деацилирования (ср. [3326]).
Сложноэфирная группировка в индо Г'илакрилоилхимотрипсине находится в несколько искаженной Z-конформации (см. рис.113). Это не согласуется с предположением [1985,3327] о Е-конформации этой связи в производных замещенных акрилоилхимотрипсинов, сделанным на основе спектральных изменений, происходящих при ацилировании фермента.
Расстояния между Ле2-атомом остатка His57 и карбонильным С-атомом ацилфермента составляют по результатам рентгеноструктурных исследований [1221,
о
1328,3328] и данным конформационного анализа [3024] от 4,1 до 4,8 А. Молекула воды в кристалле ивдолилакрилоилхимотрипсина расположена так, что она образует две водородные связи: 1) с fr^-атомом His57 и 2) с карбонильным кислородом сложноэфирной связи. Такое положение молекулы воды не является продуктивным, и в ацилферментах, подвергающихся быстрому гидролизу, вода должна занимать другое положение, которое, по-видимому, близко к положению уходящей группы в фермент-субстратном комплексе. Если это так; то расстояние между Ые2-атомом His57 и атомом кислорода воды должно составлять 2,8-
О
3,0 А. Это расстояние отвечает налйчию хорошей водородной связи и удовлетворяет условию эффективности общего основного катализа присоединения воды к карбонильной группе ацилфермента.
С общим основным катализом деацилирования согласуются стерические эффекты ацильной группы [1967]. Следует подчеркнуть, что реакционная способность молекулы воды, участвующей в деацилировании ацилферментов, содержащих специфическую ацильную группировку, близка к реакционной способности гидроксил-иона. Этот вывод был сделан [3329] на основе анализа скоростей деацилирования и щелочного гидролиза субстратов. Однако вопрос о том, обусловлена ли эта высокая реакционная способность особенностями структуры воды в активном центре ацилфермента или особенностями структуры расщепляемой связи, нуждается в дополнительном изучении.
Нуклеофильная атака молекулой воды эфирной связи в ацилферменте приводит к тетраэдрическому промежуточному соединению. Реакция типа здесь мало вероятна в силу низкого значения рК уходящей группы - серинового гидрокси-+ ^ ла (рйа R-0H-R »-1). Образование тетраэдрического промежуточного соединения подтверждается зависимостью скорости деацилирования от рйа замещенных ацил-химотрипсинов (заместитель в ацильной группе) [3330].
