Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Значительно меньше имеется сведений о катализе протонирования уходящей группы у аспартатных амидгидролаз. В случае пенициллопепсина предполагалось [13451 участие в этом процессе гидроксильной группы остатка Туг75. Следует отметить, что перенос протона от фенольной группы тирозина в кислой среде возможен только по эстафетному механизму [33141:
В структуре ферментов этого типа согласно рентгеноструктурным данным нет донорных групп типа АН, за исключением Asp215. Участие этой группы в катализе согласуется с рН-за^исимостью реакции (рЖЕЗ<*4,5). Этой груше ранее отводилась лишь роль электрофкльниго катализатора, поляризующего карбонильную группу субстрата.
По даннь'ч исследований комплекса квазисубстрата с пепсином остаток Туг75 расположен вдалеке от места связывания лиганда [3128]. Положение же остатка Asp215 вполне согласуется с его ролью в качестве общего кислотного катали-
Рис.112. Возможный механизм действия аспартатных протеаз, включающий протонирование уходящей группы субстрата путем переноса протона от гидроксильной группы тетраедрического промежуточного соединения [3131]
затора на стадии протонирования уходящей группы.
Очевидно, именно эта груша служит донором протона на уходящую группу [1715]. Это может происходить путем согласованного общего основного - общего кислотного катализа переноса протона от гидроксила тетраэдрического промежуточного соединения на Asp32 и переноса протона от Asp215 на уходящую группу [1715,33151 (см. разд. 7.10). Другой механизм [31311 заключается в переносе протона с одной гидроксильной группы тетраэдра на уходящую группу с участием протонов из среды (рис.112). Следует отметить, что согласно квантово-химическому изучению модели [3265], перенос протона от Asp215 на уходящую группу должен сопровождаться поворотом карбоксильной группы на <«180°. Не исключено, что это достигается подвижкой доменов относительно друг друга в ходе катализа (см. разд.6.5.3).
Распад тетраэдрических птэотжу точных соединений у металлосодержащих амидгидролаз - карбоксипептидазы А, термолизина и дипептидилкарбоксипепти-дазы скорее всего катализируется карбоксильной группой (Glu270 и Glu143 у карбоксипептидазы А и термолизина соответственно) [3136,3137,3316,3317]. Предположения об участии в этом процессе остатка Туг248 карбоксипептидазы А [149], как отмечалось выше, не подтвердились. Карбоксильная группа функционирует как общее основание, способствуя ионизации связанной с Zn2+ воды, и как общая кислота, перенося протоны на уходящую группу. У термолизина один
из кислородов G1U143 расположен на расстоянии 3,2. А от атома азота уходящей группы [3316]. Участие обоих атомов кислорода тетраэдра в координации с ионом Zn2+ объясняет неспособность метанола заменять воду в катализируемых металлсодержащими протеазами реакциях [3139]:
О
о
II
Glu 143—С О ОН —>
\
ОН
О ••
| His 231
©
О i^NI^CR
Glu 143—С
7.9. Ацилферменты и комплексы фермент-продукт
Распад тетраэдрических промежуточных соединений или реакции типа в случае сериновых и цистеиновых амидгидролаз приводят к образованию ацилфермен-
Доказательства того, что ацилфермента являются промежуточными соединениями на пути от субстрата к продукту, были приведены выше (см. разд.7.4) В условиях насыщения фермента субстратом стационарная концентрация ацилфермента при гидролизе специфических эфирных субстратов практически равна концентрации фермента.
При гидролизе амидных субстратов ацилфсрмент не накапливается в системе. Стационарная концентрация Н-ацетил-1-фенилаланилхимотрипсина, образующегося при гидролизе Ы-ацетил-1-фенилаланилглицинамида, при pH 5,5 составляет 0,15% [1730].
Одно время считалось, что ацилферменты - богатые энергией промежуточные соединения. Имеющиеся в настоящее время данные [1412,1730,3290,3318] показывают, что это не так. Например, изменение стандартной свободной энергии гидролиза N-ацетил-1-фенилаланилхимотрштсина при pH 7,3 составляет -3,4 ккал/моль, а при pH 5,5 близко к нулю, тогда как изменение свободной энергии гидролиза метилорого эфира ацетилфенилаланина при нейтральных значениях pH около -6,0 ккал/моль [1415]. Аналогичные данные были получены для неспецифических ацилхимотрипсинов. Так, фуроилхимотрипсин примерно на 3 ккал на моль устойчивее О-фуроил-Ы-ацетилсе рянамида [3290], а гиппурилпапаин примерно на 8 ккал/моль устойчивее соответствующих тиоловых эфиров [3318].
Образование ацилфермента - экзотермическая реакция: для ацетилхимотрип-сина д#о=-7 ккал/моль [3319] при pH 8,0. Предполагалось, что ацилирование химотрипсина нитрофениловым эфиром уксусной кислоты идет сначала с образованием ацетилированного по имидазолу His57 производного, которое изомеризу-ется в О-ацетил-(Seri95)-химотрипсин [3320]. Были получены данные, что де-ацилировг ние ацетилхи™отрипсина также идет в две стадии, однако в дальнейшем они были опровергнуты [3321].
Как уже отмечалось (см. разд.4.3.2.2), наблюдается компенсация энтальпии' и энтропии активации процесса деацилирования ацилферментов с Тс= 420°К
