Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
6,5 [1500].
Исходя из нормальных значений рХа имидазола, развивались представления [1790,3024,3309,3310] о синхронном переносе протона с гидроксила серина на уходящую группу, включагщие переходное состояние типа:
Ser 195
RNH— С —R
с'
Однако такое четырехчленное циклическое переходное состояние маловероятно по стерическим причинам.
Если же рКа имидазола, как это предполагается [1160,3028,3160,3298, 3305], увеличивается в тетраэдрическом промежуточном соединении на 2-3 единицы, образование этого соединения может полностью завершиться. Расстояние между атомами азота имидазола и уходящей группы в тетраэдре, судя по данным кристаллографии комплексов сериновых протеаз с ингибиторами -"аналогами переходных состояний", все же оказывется очень большим для эффективного переноса протона [3308]. Кроме того, как показывают квантово-химические расчеты [33111, перенос протона от ОТ-атома Ser195 на Г}е2-атом His57 сопровождается резким снижением энергии системы, и последующий отрыв протона должен быть связан с преодолением значительного активационного барьера.
Существует две возможности дальнейшего протекания процесса: 1) конформационные флуктуации в области активного центра, сближающие донор и акцептор протона [33081, и 2) участие в переносе протона промежуточного акцептора-донора, молекулы воды [33111:
•His 57
Л
Я
-Asp 102
+н"
н-----о(
н
r'hn -С(Ю—О
-(j) СН2—Ser 195
Квантово-химический анализ согласуется с обеими возможностями.
Устойчивость тетраэдрического промежуточного соединения определяется, с одной стороны, его "сольватацией", т.е. взаимодействием оксо-аниона с диполями NH-связей (Gly193 и Seri 95 в химотрипсине), а с другой - эффективностью общего кислотного катализа его распада. Эффективность сольватации была исследована на моделях - продуктах взаимодействия сериновых протеаз с пеп-тидоальдегидами [9,2860] и оценивается величиной «/7 ккал/моль [9], однако большую часть этой энергии («5 ккал/моль) относят к внутримолекулярному характеру сольватации. Исследование кинетики деацилирования N-ацетилфенилала-inM-(Memn-Ne2-Hls57)-химотрипсина [3312] позволило оценить "эффективную концентрацию" общей кислоты (имидазола His57) в ферменте, которая равна «2•10б М. Отсюда следует, что эффективность общего кислотного катализа в ферменте очень велика и существенно выше, чем эффективность этого катализа в модельных системах.
Следует отметить, что перенос протона в реакциях ферментативного гидролиза, по-видимому, может происходить путем туннелирования (см. разд.5.5). С этим предположением согласуются данные по температурной зависимости изотопного эффекта растворителя.
При гидролизе эфиров или анилидов значение рКа уходящей группы остается низким и в тетраэдрическом промежуточном соединении, и, по-видимому, нуклеофильная атака завершается образованием таких соединений. В случае эфиров возможно отщепление уходящей группы в виде алкоголят-иона (рКа«15), и его протонирование в "постпереходном" состоянии.
Как полагают [1476,1518,1519,3313], распад тетраэдра подвержен стерео-электронному контролю (см. разд.3.3.3). Вкратце эта концепция предусматривает сохранение конфигурации связи в ходе ацильного переноса. Иначе говоря, если гидролизу подвергается наиболее устойчивый в растворе эфир, имеющий Z-конфигурацию, то образовавшийся ацилфермент должен также иметь 2-конфигурацию. Это может происходить лишь в том случае, если конформация промежуточного тетраэдрического соединения такова, что отщепляемая группа имеет максимальное число антиперипланарных орбиталей по отношению к двум остальным группам тетраэдра (см. рис.35). Ситуация при химотрипсиновом катализе, возможно [1406], отвечает показанной на рис.111 и предусматривает существование стадии изомеризации промежуточных тетраэдрических соединений.
В случае папаина образование тетраэдрического промежуточного соединения при гидролизе амида было установлено на основании величины 1^-изотопного
Рис.111. Схема ацилирования химотрипсина [1406], вкпочакяцая стадии изомеризации промежуточных тетраэдрических соединений
эффекта. Отличие папаина от сериновых протеаз в этом отношении может иметь две причины. Во-первых, рКа Hls159 резко снижается в отсутствие заряда на атоме серы (см. разд.7.1), что ведет к понижению концентрации имидазолий-ионов в оптцрлуме действия фермента (рН>«6). Во-вторых, как это следует из анализа моделей комплекса папаина с субстратом (см. разд.6.5.3), в этом комплексе имеются неблагоприятные контакты уходящей группы с а-СН^-группой Hls159. Это "давление” снимается в тетраэдрическом комплексе. Возможно, поэтому уже в основном состоянии фермент-субстратного комплекса расщепляемая лвязь довольно сильно искажена в сторону тетраэдрической (высокая степень
пирамидализации), так что атака сильным нуклеофилом (тиолат-ионом) завершается быстрым образованием тетраэдра.
