Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
k =------------ (3)
а° ^-г/ггз
и при к3»к_г &ас=&г> т-е- обмен практически наблюдаться не будет.
В реакциях, катализируемых лейцинаминопептидазой и пепсином, наблюдается значительное включение 180 в непрогидролизованный субстрат [3228,3231]. Детальное исследование этой реакции показало, что это включение является следствием реакции транспептидации, т.е. переноса ацильного фрагмента субстрата на образующийся в ходе гидролиза аминный продукт:
Е + RCONHR' + Н*0------> E-RCO*OH + R'NH ,
2 с.
E-RCO*OH + NHgR'-------> E-RC*ONHR'.
Это было доказано сравнением степени включения 180- и 15N- (или 14С-) меченных продуктов в исходный субстрат [2040, 32771. Таким образом, исследования кислородного обмена в субстрате ни при отрицательных, ни при положительных результатах не являются свидетельством за или против образования тетраэдрического проме:куточного соединения.
Механизм типа включающий перенос протона на уходящую группу в пред-переходном состоянии, был предложен для химотрипсина еще в 1967 г. [3278-
3280]. Этот механизм предусматривает участие имидазола остатка гистидина в переносе протона с серинового гидроксила на азот амидной группы. Скорость реакции в этом случае должна зависеть от рКа уходящей группы:
R
Л I
о—с=о
---ч \
0 R 0“ R
1 I 1
1 1: tl
Н С=0 3 О
II
-О---
п---N NHR4 N -HNHR1
Г\ Г х> +
_И_
IN н
Н
X
\ h2nr‘ > к н
Действительно 11996,1998,3278,3281 ], электронодонорные заместители в анилиновом кольце замещенных анилидов N-ацетилтирозина увеличивают каталитическую константу (р«-2,О). Однако детальное исследование t200i] большой серии соединений, для которых значения рКа уходящих групп варьируют в очень широких пределах, показало, что на самом деле такой зависимости нет (см. также разд.4.3.2.2). Наблюдавшаяся ранее зависимость, по-видимому, является артефактом, обусловленным узкими пределами значений рКа и значительной степенью непродуктивного связывания анилидов [2000].
Представления о предпереходном переносе протона были подвергнуты критике [1999,2302,3282,3283]- Указывалось, что такой механизм не согласуется с отсутствием влияния отщепляемой группы на Кт, а также что требуемые этим механизмом скорости переноса протона (1013-1014 с-1) недостижимы. В свете современных данных об отсутствии у сериновых протеаз системы переноса заряда эта концепция может быть признана несостоятельной.
Доводы в пользу образования тетра эдрического промежуточного соединения при катализе амидгидролазами были получены [1515,3284-32861 при изучении кинетического изотопного эфЪкта с помощью введения 15N или 180 в уходящую группу субстрата (см.обзор: [1405]). Основные выводы этих работ заключаются в том, что при гидролизе эфирных субстратов химотрипсина лимитирующей стадией является образование тетраэдрического промежуточного соединения, тогда как при гидролизе амидов лимитирующей стадией является преимущественно распад этого соединения [3287,32881. В случае гидролиза бензоиларгининамида папаином изотопный эффект (14N/15N) согласуется с лимитированием гидролиза стадией распада тетраэдрического промежуточного соединения [32891. Действительно, в случае субстратов с низкоосновными уходящими группами (эфиры, ангидриды) вероятность протонирования двух потенциальных уходящих групп
О"
-CHg0-i-0R
близка, величина k_2/k3 [формула (3)1 будет большой, а распад тетраэдра в направлении ацилфермента может быть медленным №3).
В случае алифатических амидов (пептидов)
О"
различия в рКа уходящих груш велики, и скорости образования (К?) и распада (&3) тетраэдрического промежуточного сое/иненея могут быть сравнимы. С этими выводами согласуются данные по зависимости скорости ацилирования (и скорости переноса ацильной группы в ацилферменте на нуклеофильный акцептор) от рК уходящих груш (или рКа акцептора) t1533,1989,3290-3292].
Аргументы в пользу образования тетраэдрических промежуточных соединений были выдвинуты на основе изучения реакций пептид-альдегидов, кетонов и ингибиторов - "аналогов переходных состояний" (см. разд.5.8.7) с амидгидрола-зами [3293-3298]. Образование этих промежуточных соединений удалось установить в криоэнзимологических экспериментах на основе кинетических и спектральных данных [3299-3302], однако трактовка последних вызвала сомнения
[3303].
Сам факт образования тетраэдрических соединений в ходе катализа и особенно кинетическая значимость их остаются предметом дискуссий. Так, высказывалось мнение [1501], что катализируемый сериновыми протеазами гидролиз пептидов (но не зфиров или анилидов) происходит по механизму типа S^. С этим согласуются данные [3304] по изотопному эффекту гидролиза 4-метоксифе-нилформиатов химотрипсином, указывающие на ^омежу точную между sp2 и sp3 гибридизацию Карбонила в переходном состоянии.
