Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
о
мала (Дс<0,007 А). Можно, однако, предположить, что в случае "хороших" субстратов взаимодействия нереагирующих групп субстрата с ферментом могут привести к тому, что это расстояние в продуктивном фермент-субстратном комплексе будет меньше суммы Ван-дер-ваальсовых радиусов (ср. [3268]).
На рис. 109 показано изменение потенциальной энергии системы при взаимо-
действии метоксианиона и спиртового гидроксила с амидной связью N-метил-ацетамида. Следует подчеркнуть, что при расчетах сближение реагирующих атомов моделировалось таким образом, что р -орбиталь нуклеофила была направле-
о
на перпендикулярно к амидной груше. При этом на расстояниях около 2-2,3 А наблюдается понижение энергии системы, обусловленное перекрыванием связывающих орбиталей реагирующих атомов. Реакция с метоксианионом завершается образованием ковалентной связи, тогда как в случае метанола понижение энергии
РИС.109. Изменение потенциальной енер-гии при атаке метоксианионом (1) и метанолом (2) карбонильного атома углерода в N-метилацетамиде [1477]
Л Н, ппал/моль 0 Г
системы оказывается существенно меньшим и равновесная степень пирамидализации
о
составляет 0,22 А (в тетраэдре Д =0,47
о
А). Порядок связи мезвду спиртовым кислородом и карбоксильным углеродом составляет в минимуме потенциальной кривой лишь 0,5.
Это соответствует расстоянию 0-С'
о
около 1,6 А, и равновесная структура в этом формулой:
1,5 2,0 2,5 d,A
случае может быть представлена
сн3—С—ШСН3.
Дальнейшее продвижение системы по координате реакции невозможно без отрыва протона. Однако в системе создаются все предпосылки для акцептирования протона подходящим основанием, поскольку состояние атакующей группы близко к таковому у оксоний-катиона. Интересно 'отметить, что по данным рентгеноструктурного анализа комплекса трипсина и панкреатического трипсинового ингибитора [3044] расстояние мевду сериновым гидроксилом и карбонильным углеродом остатка Iys15 также больше длины ковалентной связи. Более того, расстояние мевду 07-атомом и ке2-атомом His57 в комплексе фермента с "пирами-дализованным" субстратом, как показывают исследования комплексов трипсина и химотрипсина с белковыми ингибиторами [3044], становится достаточно близким для образования хорошей водородной связи, что обеспечивает дальнейший перенос протона на имидазольный остаток.
Таким образом, нуклеофильную атаку на карбонильный углерод субстрата можно представить себе как "саморазвивающийся" процесс, при котором любое продвижение по координате реакции способствует дальнейшему взаимодействию реагирующих атомов. Следует подчеркнуть, что выделение .громежуточных состояний на пути от основного состояния системы к переходному лишено смысла,
21. В.К. Антонов
если процесс представляет собой действительно элементарный акт, происходящий за время флуктуации, т.е. за время порядка 10-1г-1СГ13 с. Поэтому эффективность процесса в данном случае должна зависеть только от начального (основного) состояния системы - сближенности нуклеофила и карбонильного углерода и степени дестабилизации расщепляемой группировки. Этим, по-видимому, ферментативная реакция отличается от неферментативной, где удерживание реагирующих компонентов в положении, максимально благоприятном для реакции, невозможно из-за свободного теплового движения молекул. Фермент, следовательно, создает "рамку" или "коридор", направляющий элементарный акт строго по пути реакции.
Тот факт, что многие ферментативные реакции проходят с диффузионноконтролируемыми скоростями (см. разд. 4.4), является убедительным свидетельством весьма низких энергий активации собственно элементарного акта химического превращения субстрата. Для "идеальных" субстратов энергия активации этого акта, по-видимому, всегда ниже энергий активации диффузионноконтролируемых реакций (««Б ккал/моль).
Сходной точки зрения на механизм нуклеофильной атаки у сериноьых протеаз придерживается ряд других исследователей [1330,3044,3045,3060,3062,3103, 3104]. Интересно отметить, что расщепление р-лактамного цикла в бензилпе-нициллине р-лактамазой из EseAerlchta coli происходит с константой скорости второго порядка (&саг/Ж.п)“1 -Ю8 М-1с-1, т.е. со скоростью, близкой к диффузионно-контролируемой. Однако эффективность этого фермента (k /К k =109;
Са JTi YL
см. табл. 50) не превышает эффективности других амидгидролаз. р-Лактамное кольцо в пенициллинах уже практически лишено резонансной стабилизации (см. разд.1.3.1), и механизмы дестабилизации расщепляемой связи у этого фермента, по-видимому, не должны функционировать. Остается важный фактор эффективности - ориентация, т.е. расстояние между нуклеофилом фермента и карбонильным углеродом, которое должно быть оптимальным для эффективного катализа. Вероятно, невыполнение этого условия и приводит к низкой скорости гидролиза других неспецифичных для этого фермента субстратов.
