Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Исследования комплексов химотрипсина с различными ингибиторами методами ЯМР [3115-31181 в целом подтверждают характер взаимодействий, наблюдающихся для кристаллов фермента. Следует отметить, что кристаллы химотрипсина и протеазы А были получены при рН«4, т.е. в таких условиях, когда ферменты теряют активность. Однако в случае протеазы А кристаллы все же гидролизуют пептидный субстрат [3063З, а кристаллы химотрипсина, полученные при более высоких значениях pH [1222,31191, не имеют существенных отли-шй от кристаллов "кислой формы".
Причины первичной стереоспецифичности химотрипсина, как показали рентгеноструктурные данные, а также результаты ЯМР-К' мплексов с I- и D-трифтора-цетил-п-фторфенилаланином [3116,3117] и трифторацетилтриптофаном [3015], заключаются в том, что ацильная группа D-изомера ориентирована в комплексе в направлении пары Ser195-His57, тогда как правильная ориентация 1-изомера позволяет этой группе образовывать связь с СО-группой Ser214.
Расчеты методами молекулярной механики показали, что в тетраэдрическом промежуточном соединении L-AcTrpOH на 9 ккал/моль стабильнее, чем D-форма [30151. Отсюда делается вывод, что стереоспецифичность проявляется в переходном, а не основном состоянии субстрата. Подобные расчеты комплексов BPTI с трипсином Г3094,3120,31211 подтвердили представление [1235,30951 о том, что причиной ингибиторных свойств этого и сходных ингибиторов является жесткость фермент-ингибиторного комплекса и экранирование в комплексе остатка гистидина-57 от воды.
Цистеиновые протеазы. Данные рентгеноструктурного анализа комплексов
цистеиновых амидгидролаз с субстратоподобными соединениями сравнительно не-мночисленны. Имеются сведения о структуре папаина, ингибированного хлорме-тижетонами [3122], комплексов этого фермента с микробными ингибиторами Е-64 [3069] и Е-64с [2735], а также модель комплекса папаина с цистатином куриного яйца (на основе рентгеноструктурных данных для фермента и ингибитора [27973). Как уже указывалось, папаин специфичен к пептидам, содержащим ароматическую аминокислоту в положении Pg. Активный центр этого фермента представляет собой ''щель”, расположенную между двумя доменами белковой молекулы. Длина "щели” такова, что в ней могут расположиться семь аминокислотных остатков - четыре в подцентрах S1-S4 и три в подцентрах
Анализ структуры папаина, модифицированного по SH-группе остатка Cys25 хлорметилкетонами ZPheAlaCH2Cl и AcAlaAlaPheAlaCHgCl (рис.99), показал, что
РИС.99. Стереоизображение участка активного центра папаина, модифицированного бензилоксикарбонил-Х-фенилаланил-Х-аланилхлоркетоном [3122]
остаток фенилаланина занимает участок S2, образованный остатками Тугб7,
т>го68 и Тгр69 одного домена и остатками Phe2Q7, Ala16Q, Val133 и Val157
другого домена белка. При этом происходит вытеснение молекулы воды. Карбо-
нильная и NH-группы этого остатка ориентированы в направлении пептидной связи Gly65-Gly66 и могут образовывать с ней водородные связи. С^-атом остатка Phe образует Ван-дер-ваальсовы контакты с Cs Ргоб8 и А1а160, а фе-нильная группа контактирует в основном с остатками Val133 и Val157.
Аминокислотные остатки в положении Р1 располагаются вблизи основной цепи остатков Gly23 и Ser24 белка. Связывание остатка Р также приводит к вытеснению молекулы воды. Карбонильная группа Р1 направлена в сторону амидной
группы боковой цепи Glyl9, однако расположение групп СО(Р1), Ne2 Gln19 и NH Cys25 не является оптимальным для образования водородных связей у этих производных фермента.
Имеющиеся данные не позволяют оценить расстояние между карбонильным С-атомом истинного субстрата и атомом серы, а также между N51-атомом His159 и уходящей группой. В свободном ферменте расстояние Ns His;59-?7 Cys25 сос-
о
тавляет 3,4 А [148], что достаточно для образования водородной связи между ними.
Очень сходным образок связываются с папаином эпоксидные ингибиторы Е-64 и Е-64с С2735.3069 3. Эти соединения образуют ковалентные связи с атомом серы Cys25, который атакует С2-атом эпоксидного цикла, причем наблюдается инверсия конфигурации этого'атома. Карбоксильная группа ингибитора образует Н-связи с амидной группой Gln19 и NH основной цепи Cys25, а также в случае Е-64с Ne2 атомом остатка His159.
Остаток Р3 хлорметилкетонов, а также концевая изопропильная (у ’3-64с) и концевая гуанидиногруппа (у Е-64) связываются вблизи боковой цепи Туг67, и остаток Ala в этом положении находится в контакте с фенольным кольцом Туг61 и С^-атомом Gly65.
Связывание ингибиторов папаином гфиводит к довольно значительным конфор-мационным изменениям в белке. В случае хлоркетонов атом серы Cys25 сдвига-
о
ется на 0,9 А в глубь белковой глобулы, что сопровождается перемещением атомов основной цепи остатков Ser24 и Gly43. При этом боковая цепь Sen 76 поворачивается вокруг связи Са-С^ на «120° так, что ее гидроксильная группа располагается на расстоянии водородной связи от 0e1 Gln19.
