Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Эта дисторсия, по-видимому сохраняется и в ацилферментах, о чем говорят данные резонансных Раман-спектров хромогенных ацилхимотрипсинов [3100, ЗЮ1 ].
Следует отметить, что не во всех комплексах белковых ингибиторов с протеазами наблюдаются отклонения амидной группы "реакционного центра" от планарности [3042,3067]. Более того, в некоторых ацилферментах, например в ацилпапаинах, наблюдается увеличение двоесвязанности расщепляемой одинарной C-S-связи [3093,3102].
Хотя степень дисторсии амидной связи в кристаллах комплексов амидгидро-лаз с субстратоподобными ингибиторами зависит от метода уточнения кристаллографических параметров [3066], сам факт такой дисторсии, по-видимому, не вызывает сомнения. Это обстоятельство может иметь важное значение для понимания эффективности и специфичности амидгидролаз [1715,3103,ЗЮ4] (подробнее см. гл.8).. Дисторсионный механизм катализа, по-видимому, наблюдается также у пептидилпролин цыс-транс-изомеразы [3105].
6.5.3. Расположение на ферменте и взаимодействия
В этом разделё мы детально рассмотрим, как располагаются субстратоподобные соединения в активных центрах некоторых ферментов, судя по данным рентгеноструктурного анализа.
Сериновые протеазы. Имеются довольно подробные данные о структуре комплексов сериновых протеаз с квазисубстратами, продуктами гидролиза и ингиби-
Рис.96. Стереопара расположения AoProAlaProTyrOH в активном центре протеазы А ИЗ Streptomycee grieeue [3063]
торами (см. табл.69). Взаимодействие ароматического кольца субстрата в положении Р впервые было описано в работе [13293 на примере комплекса химотрипсина с формил-i-триптофаном, а вторичные взаимодействия - на примере комплексов трипсина с панкреатическим трипсиновым ингибитором [3043,3044] и комплексов протеазы А из Streptomyces griseus с тетрапептидами типа AcProAlaProTyrOH [3063] (рис.96).
Участок связывания боковой цепи остатка Р1 (S1-участок) у химотрипсина ограничен "снизу" цепью остатков 213-220, а "сверху” остатками 190-192. В глубине этого "гидрофобного кармана" расположена боковая цепь остатка Sen89, а снаружи - боковая цепь остатка Met192.
Ароматическая группа квазисубстратов химотрипсина погружена в этот гидрофобный карман так, что ее плоскость параллельна плоскости амидных связей Seri90-Cys191 и Тгр215-Gly21б. Ср-атом субстрата по данным ЯМР [3106], по-видимому, контактирует с растворителем.
В трипсине остатки Lys или Агд субстрата расположены аналогичным образом, однако существенным отличием трипсиноподобных ферментов от ферментов химотрипсиновой группы является наличие в первых остатка Asp189 (вместо Sen 89). Заряженные группы субстрата образуют с карбоксилат-ионок этого остатка солевую связь [1235].
Отличие S1-участка субтилизинов от соответствующего участка в химотрип-сине заключается в том, что он значительно более открыт и доступен растворителю, так что связывающаяся в этом участке ароматическая группа одной своей стороной а зонирована в растворитель [3060]. То же самое наблюдается в комплексах субтилизинов с макромолекулярными ингибиторами, где боковые цепи гидрофобных остатков (Рго42, Leu45, Leu47 в эглине 0) частично контактируют с растворителем [3056,3107]. Наконец, в случае панкреатической элас-тазы [ЗЮ8] в положениях 216 и 226 вместо остатков Gly (у химотрипсина и трипсина) имеются соответственно остатки Val и Thr (Asp в лейкоцитарной эластазе). Наличие этих остатков препятствует связыванию объемистых группировок и играет определяющую роль в специфичности эластазы к боковым цепям
19. В.К. Антонов
остатка Ala в Р1.
Расположение ароматической групгы в локусе S1 протеазы А практически идентично расположению триптофанового остатка в химотрипсине [30631.
Остаток тирозина в комплексе протеаза А - продукт (AcProAlaProTyrOH) образует несколько водородннх связей (рис.96).
Это, во-первых, водороцная связь с карбонильной группой остатка Ser214
О
(3,03 А), важность этой связи для катализа постулировалась неоднократно, однако ее не удалось обнаружить в комплексе Сормклтриптофана с химотрипсином [13291 и в комплексах с трипсином [12311. Она также не выявляется при расчете конформации субстратов в активном центре фермента методом атом-атомных потенциалов [3024-1. Однако эта связь обнаруживается в алкилирован-ных пептидными хлорметилкетонами сериновых прстеазах, а также в комплексах этих ферментов с белковыми ингибиторами [3040,3043,30611.
Три водородных cbji3h образует карбоксильная группа остатка тирозина:
а) с прочэнированным Ие2-атомом HlsST (2,82 А); б) с NH пептидной группы
О О
остатка Gly193 (2,81 А) и в) слабую связь <<*3,2 к) с Ш-группой Sen95.
Первая связь имитирует перенос протона на уходящую группу в субстрате, а вторая и третья, характерные для карбонильных групп субстратов и ацилфер-ментов, составляю; участок связывания, называемый "оксианионной полостью" [1328,30601.
Водородные связи с NH-группами остатков Glyl93 и Sen 95 наблюдаются практически во всех комплексах сериновых протеиназ с белковыми субстратоподобными ингибиторами [3021,3044,3049,3066,31091. Как уже отмечалось выше, во многих из этих комплексов амидная "руппа "реакционного центра" пирамида-лизована. Это приводит к тому, что расстояние между От-атомом Sen95 и карбонильным углеродом потенциально расщепляемо? связи снижено по сравнению с
