Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Следует отметить, что до сих пор не существует общепризнанных представлений о причинах термостабильности некоторых белков, хотя в этом направлении ведутся обширные теоретические и экспериментальные исследования [2496-2500]. Два фактора, по-видг:мому, играют доминирующую роль - гидрофобное взаимодействия и конформационная энтропия разворачивания глобулы. Предпринимаются попытки увеличить стабильность ферментов методами направленного мутагенеза [2501].
Температурная устойчивость амидгидролаз и многих других ферментов может быть сильно увеличена при иммобилизации, т.е. химическом или сорбционном связывании с нерастворимым носителем (см. обзор: [2502]). В качестве примера укажем здесь лишь на иммобилизацию а-химотрипсина в структуре сшитого полиакриламидного геля. Удалось получить препарат фермента, выдерживающий длительное кипячение в воде [2503].
5.7. Криоэнзимология амидгидролаз
Если верхний предел температурной устойчивости ферментов удается отодвинуть методами иммобилизации, то нижний предел, связанный с температурой замерзания растворов, можно преодолеть, используя смеси воды с органическими растворителями, имеющие низкую температуру замерзания. Эти методы, ставшие основой криоэнзимологии, подробно описаны в ряде обзоров и монографий [2421, 2504-2506].
Впервые исследование ферментативного гидролиза при отрицательных значениях температуры было предпринято в 1964 г. [2507] с использованием смесей метанол - вода. Дальнейшие обстоятельные исследования свойств различных смесей при низких температурах позволили рекомендовать условия, когда диэлектрическая проницаемость смеси соответствует величине, характерной для водных растворов при нормальной температуре [2421].
В криоэнзимологических исследованиях используются также концентрированные растворы NaCl [2508,2509]. ацетата аммония [2510], а также полиэлектролиты [2511].
Объектами криоэнзимологических исследований были реакции, катализируемые химотрипсином [2512-2515], трипсином [2516-2519], папаином [2520-2522], карбоксипептидазой А [2508,2509,2523,2524], пепсином [2525], пенициллопеп-сином [2526], лейцинаминопептидазой [2527-2529] и р-лактамазами [2510, 2530].
Оказалось, во-первых, что зависимости каталитических констант от темпе-ратуоы во многих случаях подчиняются уравнению Аррениуса вплоть до температур порядка -50-=—60°С. Во-вторых, при низких температурах удается существенно замедлить отдельные стадии процесса и таким образом идентифицировать
некоторые промежуточные соединения в катализе. Так, при pH 5,5 и -40°С в смеси диметилсульфоксид - вода (65:35) удается выделить ацилхимотрипсин, образующийся при гидролизе n-нитрофенилового эфира ацетилтриптофана [2512]. В то же время в случае пепсина, пенициллопепсина или лейцинаминопептидазы обнаружить ковалентные промежуточные соединения не удалось [2525-2527]. Было сообщено [2524] о прямом доказательстве образования промежуточного ангидрида в ходе катализа карбоксипептидазой А при низких температурах. Вместе с тем спектральные исследования [2508,2509] свидетельствуют скорее об отсутствии такого промежуточного соединения, но дают четкие доказательства образования второго фермент-субстратного комплекса (см. гл.6). Такое же двухстадийное комплексообразование обнаружено в случае лейцинаминопептидазы [2528,2529], а для трипсина зафиксирована изомеризация в каталитически менее активную форму [2518], а не образование тетраэдрического промежуточного соединения, как это предполагалось ранее [2531].
Криоэнзимологическая техника начинает получать применение и в рентгеноструктурном анализе [2532-2534], позволяя в принципе изучать структуру комплексов ферментов с истинными субстратами, а также в ЯМР [2535].
5.8. Мицеллярная энзимология
В последнее время появились новые интересные возможности изучения ферментативных реакций при низких температурах [2516,2536]. они заключаются в создании в органическом растворителе обращенных мицелл (рис.81). Это удается сделать, вводя в систему поверхностно-активное вещество, например, бис-(2-этилгексил)-сульфосукцинат натрия [2536] или лецитин [2537].
Рис.81. Схематическое изображение обращенной мицеллы поверхностно-активного вещества (ПАВ) в органическом растворителе (а) и фермента, включенного в мицеллу (б)
1- ионная (полярная>; г- углеводородная группа в молекуле ПАВ;
3- противоионы или солюбилизированные молекулы воды; 4- молекула фермента
Основные принципы мицеллярного катализа изложены в разд.3.4.9. Реакции в мицеллах широко используются при обычных температурах (см. обзор: [1631] и цит. лит.). Каталитическая активность в этих условиях зависит от соотношения вода/поверхностно-активное вещество, проходя через максимум. В максимуме создается оптимальное соотношение между диаметром внутренней полости и размером белковой молекулы. Эффективность катализа по сравнению с водными растворами сильнее снижается для более специфичных субстратов, чем для простых производных ациламинокислот [2538].
Достоинствами обращенных мицелл являются оптическая прозрачность растворов, их низкая вязкость и низкие температуры замерзания.
