Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
kT AS* АН* 1
1пй = In — +-------------(17)
h R R Т
где к - константа Больцмана; Т - абсолютная температура; h ~ постоянная Планка; R - универсальная газовая постоянная; дБ* - энтропия и дН* - энтальпия активации.
Температура также влияет на константу диссоциации фэрмент-субстштногО' комплекса в соответствии с уравнением Вант-Гоффа
AS д Н 1
— о о 1
1пК =--------------, (18)
в R ВТ
где Кд = 1/Кд, а дSQ и дНо - энтропия и энтальпия комилексообразования.
Константа скорости второго порядка *2/Яз будет, таким образом, связана с температурой выражением:
Й_ , m hS*~txS дН^-дН А
2 k 1 о о I
In — = In + — ------------(---------)—. (19)
К h R R Т
3
Строя зависимости логарифмов кинетических констант от обратной температуры, можно определить значения tJ5*, aSq, дй* и дHq.
Особенности температурной зависимости ферментативных реакций по сраше-нию с неферментативными являются следующие: 1) значения энтальпии и энтро-
пии ферментативного процесса могут иметь смысл, только если соответствующие кинетические константы относятся к элементарному акту химического превращения субстрата или к истинной константе равновесия (то же, несрмненно, справедливо и для неферментативной реакции, но в этом случае проверить выполнимость указанного требования значительно легче); 2) зависимость кинетических констант от температуры, описываемая уравнениями (17)—(19), соблюдается для ферментативных реакций в сравнительно узком интервале температур, определяемом точкой замерзания раствора и устойчивостью фермента к тепловой денатурации; 3) температура может изменять рКа каталитически активных групп фермента и тем самым изменять скорость реакции; 4) на графиках Аррениуса для ферментативных реакций часто наблюдаются изломы, причины которые будут обсуждены ниже.
Существует мнение [2450], что уравнение Эйринга-Поляни и эмпирическое уравнение Аррениуса
дЕ
1пй = 1гь4-------- (20)
ДУ
неприменимы к реакциям биополимеров. Основная аргументация при этом сводится к следующему: а) дН* и дЕ - независимые величины, а связывающее их выражение
сЛ* = дЕ - КГ (21)
имеет лишь тот смысл, что существует некоторая температура Т, при которой зависимости lnfe от 1/Г, описываемые уравнениями (17) и (20), имеют одинаковый наклон; б) постоянство д5, А, дЯ и дЕ в ферментативных реакциях кажущееся, обусловленное узостью температурного интервала измерений; в) даже в этом узком интервале изменение температуры приводит к изменению структуры биополимера, г) образование фермент-субстратного комплекса приводит к значительным перестройкам белковой молекулы.
При всей основательности этой критики все же измерения кинетических констант в зависимости от температуры широко используются для характеристики ферментативных реакций; по-видимому, они имеют смысл, особенно, если проводится сравнение серии однотипных субстратов. Кроме того, широкое распространение получают прямые калориметрические методы измерения тепловых эффектов реакции, лишенные ряда перечисленных недостатков, а также расширяется диапазон температур измерений с использованием криоэнзимологических методов (см. разд.5.7).
Как равновесие обратимой реакции, так, следовательно, и скорость ее могут изменяться при изменении давления. Экспериментально это обнаруживается при давлениях, превышающих 1000 атм. Изучая влияние давления на константы скоростей ферментативных реакций, можно получить важные сведения об их механизме (см. ра’зд.5.6.2). Измерение влияния давления на Кт позволяет вычислить изменение объема (aV) при образовании комплекса Михаэлиса, а из данных по изменению константы скорости можно получить величину объема активации (дУ*) [2451]:
LV*
1П& = 1П*--------Р,
о RT
где й ¦- константа скорости при Р = 0+1 атм.
Строя зависимости логарифма константы от давления получают прямую (если
aV*
t\Vr не зависит от давления) с наклоном------------. Объем активации прямо связан
КГ
с энтропией активации и характеризует изменение в структуре переходного состояния по сравнению с основным состоянием реагирующей системы.
5.6.2. Экспериментальные данные
Анализ данных табл.56 позволяет сделать вывод о том, что специфичность фермента может определяться изменением как энтальпии, так и энтропии активации. Относительный вклал каждого из этих параметров зависит от типа катализатора и выбранной серии субстратов. Так, скорость деацилирования К-ацил-аминоацилхимотрипсинов определяется, в основном, изменением энтальпии активации (см. рис.60), тогда как переход от этих производных к соответствующим производным фермента, ацилированного алифатическими кислотами, приводит к изменению энтропии активации стадии деацилирования, а энтальпия процесса изменяется очень мало [1992]. Энтальпийный "контроль” четко проявляется при пепсиновом катализе, тогда как в случае эластазы преобладает вклад энтропии.
