Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
5.3.2. Влията ионной силы раст^ола
Добавление солей может изменять каталитические свойства ферментов за счет увеличения иончой силы раствора [1404, гл.7; 2410]. Этот вопрос был подробно исследован на примере сериновых протеаз - химотрипсина и трипсина [2411-34151 - Было показано, что при гидролизе этилового эфира ацетил -1-тирозина химотрипсином изменение концентрации NaGl приводит к пропорциональному увеличению ftcat и уменьшению Кт (рис.76) [2415]. Интересно, что ионная
Рис.76. Зависимость кинетических констант катализирузыого химотрипсином гидролиза втилс вого ефира N-ацетилти-розина от концентрации NaO] (pH 7,9;
25°С) [2415]
0,5 1,0 1,5 С, м
сила оказывает даже больший эффект на гидролиз химотрипсином специфических длл трипсина субстратов типа BzAigUist (примерно в 8 раз по *cat/Km), чем на гидролиз специфических для химотрипсина субстратов (в 3 раза); рП-зависи-мость кинетических констант практически не меняется при увеличении ионной силы в области pH 6-10, однако при более кислых значениях pH (<5) наблюдается обращение эффекта ионной силы на fecat (по гидролизу AcTyrOEt) для химотрипсина. В случае трипсина эффект ионной силы носит обратный характер -с увеличением концентрации соли уменьшается ft и ft ./К (для BzArgOEt
CQt CQt m
примерно в 2 раза) и увеличивается Кт [24153, причем изменение pH в интервале 5-7 не сказывается на этом эффекте. Концентрация соли влияет в случае
химотрипсина, в основном, на константу скорости ацилирования фермента №2) и в меньшей степени на константу скорости деацилирования №3).
По своему эффекту различные катионы располагаются в ряд-, идентичный лиотропному ряду Гофмейстера:
Ка+>L1+ >К+ >NH+ >Ме,N+,
4 4
а анионы - в следующий ряд:
S02~>Cl_>Br“>Ac0_>N0~>I_>G107>CNS_.
4 3 4
Влияние соли на константу диссоциации фермент-субстратного комплекса, по крайней мере, в случае химотрипсина, можно объяснить так называемым высаливающим эффектом, т.е., влиянием на активность субстрата Cfs) при постоянстве активностей фермента (т„) и фермент-субстратного комплекса (ТЕЗ) [2416]. Это справедливо при относительно больших концентрациях соли. При переходе от низких ее концентраций к высоким (больше 0.5 М) происходит, по-видимому, изменение конформации фермента [2416,2417], что проявляется в параллельном с изменением активности изменении поглощения белка при 282 нм [2416].
Карбоксипептидаза А в отличие от химотрипсина ингибируется анионами, причем эффективность ингибирования снижается в ряду:
po^“>so2“>n:>ci_.
4 4 3
Предполагается, что ионы фосфата и хлора взаимодействуют с остатком Arg в субстратсвязывающем центре [2418], а ион N~ взаимодействует с атомом Zn [2419]. Следует отметить, что избыток ионов Zn подавляет активность карбок-сипептидазы А [2420] и ряда других Zn-содержащих протеаз.
5.4. Влияние органических растворителей
Органические растворители могут влиять на каталитическую активность ферментов, и в том числе амидгидролаз, изменяя диэлектрическую проницаемость раствора и коэффициент распределения субстрата между фазами растворителя и белка, а также специфически конкурируя с субстратом за активный центр. Кроме того, растворители, содержащие нуклеофильные функциональные группы, могут конкурировать с водой в гидролитических реакциях. Здесь будут кратко рассмотрены лишь два первых эффекта растворителя.
Изменение диэлектрической проницаемости влияет на ионизацию компонентов буфера и на рХа поверхностных групп белка (см. обзор в: [2421]). Это в свою очередь приводит к изменению ргрупп, маскированных внутри глобулы, в том числе и групп активного центра фермента. Изменение констант диссоциации карбоксильной и аминогруппы в зависимости от содержания органического растворителя в воде может достигать нескольких порядков (рис.77) [2422,2423].
Имеется много данных о влиянии изменения диэлектрической проницаемости на каталитические свойства ферментов (обзоры ранних работ см. в: [2424], с.205; 2425, гл.15]). Так, линейная корреляция скорости катализируемого трипсином гидролиза BzArgOEt и обратной величины диэлектрической проницаемости (1 /I)) была обнаружена для большого числа смесей воды с органическими
рКа
10,0
Рис.77. Зависимость рК ионогенных групп
некоторых соединений от концентрации ди-оксана в воде
1- уксусная кислота; 2- трис;
3- бензоиларгинин; 4- глицин (СООН);
5— глицин(НН3+)
5,0'
растворителями [2426]. Изменение состава среды относительно мало влияет на й t. но значительно изменяет величину Кт [2423.2427,24283. pH-Зависимости ^cat в воде и в водно-органических смесях практически не отличаются [2423]. Было покавано [24291, что многие протеазы в водно-органических растворителях теряют амидазную, но сохраняют эстеразную активность. Исследования влияния органических растворителей на кинетику ферментативного гидролиза осложняются специфическими эффектами, о которых говорилось выше [2427,2430], а также довольно узким диапазоном изменений диэлектрической проницаемости, используемым в большинстве работ. Изучение гидролиза AcTrpOEt и BzArgOEt, катализируемого соответственно химотрипсином и трипсином в широком интервале значений диэлектрической проницаемости, показало отсутствие корреляции 1/D и значений &cat и Кт- В системах, где превалируют электростатические фермент-субстратные взаимодействия, изменения диэлектрической проницаемости среды не влияют на Кт. В то же время наблюдается хорошая корреляция lgi ca-t/^m И величины свободной энергии переноса субстрата из воды в смешанный ¦ растворитель. По- гидимому, влияние органического растворителя на Кт проявляется в том случае, когда в образование.фермент-субстратного комплекса существенный вклад вносят гидрофобные взаимодействия [2431]. При высоких концентрациях органического растворителя исследования осложняются денатура-ционными процессами, однако этого не происходит, если реакцию проводить с суспендированным в сухом органическом растворителе ферментом.
