Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Nbz - гг-нитробензол; РА - фууила^срилоил.
пептидов, содержащих аминопропилморфолиновую С-защитную группу [2323]. Ни одно из этих соединений не должно изманять свое состояние ионизации в области исследуемых значений pH.
По-видимому, значения р#а пепсина и некоторых других аспартатных протеаз не характеризуют ионизацию групп активного центра [2334].
Различия рКа свободного папсиин для субстратов, содержащих евобедную и защищенную С-концевую карбоксильную группу, обусловлены ионизацией послед-
ней при рН«3,5 [2335-2337J. Это сопровождается увеличением константы диссоциации фермент-субстратного комплекса [2338]. Следует отметить, что наличие фосфатной грушш в пепсине влияет на значения рК фермента [1216,23391-
Так, было показано, что рКа комплекса фермента с AcPheTyrOMe у дефосфорили-
рованного пепсина равны 2,1 и 4,6, тогда как для нативного фермента эти
значения составляют 1,6 и 4,1 [1216].
В табл.54 для свободного химотрипсина приведено одно значение рйа> хотя на самом деле обычно наблюдается еще одно значение в области 8,8-9,О. Это последнее значение обусловлено обсуждавшимся выше конформационным переходом в неактивную форму. Интересно отметить, что 6-химотрипсин более стабилен в щелочной среде, чем а-химотрипсин [2066,2306].
Исследования, проведенные в широком диапазоне pH показали, что смена лимитирующей скорость стадии - довольно частое явление. Так, при гидролизе n-нитрофениловых эфиров ациламинокислот трипсином [2З1З] и панкреатическим калликреином [2340] в кислых pH лимитирует общую скорость стадия деацилирования, а при рН>4,4-4,8 - стадия ацилирования. В случае лейкоцитарной эластазы [2317] и папаина [2341] наоборот - в кислых pH медленной стадией является ацилирование, а при увеличении основности среды такой стадией становится деацилирование фермента.
Осложнения в определении рКа каталитически активных групп могут возникнуть и вследствие недостаточно продуманного выбора условий. Например, определение рКа химотрипсина при низких pH (5-6) и высоких концентрациях фермента приводит к нелразкльннм результатам, так как эти условия максимально благоприятны для димеризации фермента, влияющей на величину fecat [2298]. В папаине [2342-2347] рйа остатка Cys25 зависит от того, включена ли его SH-группа в солевую связь с His159 или нет. В то же время рйа His159 также зависит от наличия или отсутствия солевой связи. Кинетические исследования не позволяют различить два состояния, несущие одинаковый суммарный заряд:
R-S”_____HIm+ и R-SH_______Im.
Поэтому для решения вопроса об ионизации каталитически активных групп папаина широко используются физико- химические методы и методы химической модификации. Из физико-химических методов, используемых для определения рКа каталитически важных групп фермента, следует в первую очередь отметить ЯМР [2348-2352], а также ИК-спектроскопию [2353-23551, разностную УФ-спектро-скопию [2356,23571 и флуоресцентный анализ [2356,2358].
Использование методов химической модификации для тех же целей описано в работах [2359-23631. Влияние pH на конформационное состояние фермента удается выявить при рентгеноструктурном анализе кристаллов, выращенных при различных значениях основности среды [23521.
5.3. Влияние ионов и ионной силы раствора
Следует различать специфическое и неспецифическое действие ионов на ферменты. Специфическим является действие лишь одного типа ионов (анионов или катионов), тогда как неспецифическое действие вызывается ионами разной природы за счет изменения ионной силы раствора и обычно связано с их лиотропны-
ми свойствами. М::огие амидгидролазы содержат в своем составе конституи-тивше ионы, играющие роль простетических групп. Влияние этих ионов рассмотрено в других разделах.
5.3.1. Специфические иош
Ряд катионов и анионов могут активировать или ингибировать амидгидролазы. Среди активаторов наибольшее распространение имеют ионы Са2+ и Mg 2t Моны Са2+ связываются с такими сериновыми протеазами, как химотрипсин, трипсин, эластаза и др. Однако они, как правило, не влияют на активность этих ферментов, а стабилизируют их в отношении автолитического расщепления [2364-23713. Ниже приведены константы ассоциации некоторых сериновых протеаз с ионами Са2+ [2368-23713:
Фермент К-10 4, М 1 Фермент Я-10“4, М 1*
а-Химотрипсин 0,92 Термомиколин 50,0
Трипсин свиньи 22,0 Субтилизин BPN' 10б
Трипсин быка 11 ,0 Термитаза 108
Эластаза 21 ,0 Протеиназа К 103
"Приведены значе ния для наиболе ;е прочно связывающе! пося иона Са2+.
Исследования связывания Са2+ удобно проводить, вытесняя этот ион некоторыми ионами лантанидов (ТЪ3+, Ln3+, Gd3+) и измеряя флуоресценцию присоединяющихся ионов (ТЪ3+) или сдвиг линий в спектрах ЯМР [2372-23743. Эти исследования, а также рентгеноструктурные данные позволили установить И 233, 23753, что в трипсине ион Са2+ связывается в области остатков 70-80, образующих полипептидную петлю, причем акцептором иона служит Glu80. В химо-трипсине в этом положении расположен остаток Не, что объясняет значительно более низкое сродство Са2+ к этому ферменту. Субтилизины и близкие им ферменты связывают от 2 до 4 ионов Са2+ с разной степенью прочности.
