Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Значительно сложнее происходит активация прокарбоксипептидазы А [2268, 2269]. Этот зимоген состоит из трех субъединиц, из которых лишь одна -субъединица I - является собственно зимогеном карбоксипептидазы А, а две другие - химотрипсиноген С и неактивная форма эластазоподобного фермента -протеазы Е [50J,22701. Прокарбоксидаптидаза А имеет молекулярную массу около 45 кДа [2271] (другая форма у свиньи 71 кДа [2272]) и значительно быстрее активируется трипсином, будучи выделена из комплекса (в виде сукцинили-рованного производного), чем в составе комплекса. При этом отщепляется около 100 аминокислотных остатков [2273-2276] и образуется смесь нескольких форм фермента, отличающихся N-концевой аминокислотой (см. разд.2.4.4). Следует отметить, что в поджелудочной железе акулы прокарбс ссипептидаза содержится в мономерной форме t3031.
Интересно упомянуть данные о процессинге мембранного фермента препени-циллиназы из Bacillus llchenlformls [2277,2278]. Зимоген этого фермента и сам фермент - липопротеины, содержащие в положении Cys27 (профермента)-аце-тилглицеридную группу. Активация идет путем расщепления связи Gly26-Cys27, причем липидный остаток, по-видимому, определяе-о локализацию белковой цепи в мембране.
Как уже отмечалось, у многих микробных амидгидролаз нет тоформы, т.е. истинного зимогена. Активация происходит сразу после отщепления лидерной (сигнальной) последовательности. Вообще предполагается [4], что зимогены появились на поздних этапах эволюции. Так, у тршсиногенов морских звезд, по-видимому, нет предшественников [22791, нет их и у химотрипсиноподобных
14»
ферментов из Streptomyces grlaeua [2280].
Интересно рассмотреть отличия в пространственной структуре ферментов и их зимогенов. Этот вопрос был подробно исследован на примере пары а-химо-трипсин - химотрипсиноген А [1229,2281-2283]. Наибольшие изменения происходят в облагти расщепляемых связей 11е16 и Arg145. Остаток 11е16 имеет решающее значение для формирования активного центра фермента, так как он образует солевую связь своей аминогруппой с карбоксильной группой остатка Asp194, которая в зимогене экспонирована в область связывающего субстрат участка белка. Существенные изменения происходят и в области остатков 189-193, образующих эту субстратсвязывающую область. В результате активации химотрипсиногена происходят два важнейших события - формирование субстратсвя-зываюцего участка и формирование так называемой оксианионной полости за счет изменения ориентации карбонильной группы остатка Gly193 И 229.1. Что касается каталитического аппарата - "системы переноса заряда", образуемой остатками Asp102-His57-Ser195, то в зимогене она сформирована более четко, чем в самом ферменте [12291. По-видимому, вследствие этого химотрипсиноген обладает некоторой каталитической активностью. Как химотрипсиноген, так и трипсиноген медленно реагируют с диизопрогшлфторфосфатом [22841 по каталитически активному остатку серина, связывают конкурентные ингибиторы [22851, а трипсиноген образует прочный комплекс с панкреатическим трипсиновым ингибитором [1233,22861. Было показано [22871, что пептиды (например, IleVal) индуцируют переход трипсиногена в конформацию, характерную для трипсина, т.е. эти пептиды способны как бы замещать N-концевой фрагмент зимогена, формируя связывающий участок активного центра. Предполагается, что аналогичный механизм реализуется при активации плазминогена стрептокиназой [2287,22881.
Таким образом, по крайней мере для трипсина и химотрипсина основное различие зимогенов от активных протеаз - конформационное. Это подтверждается также данными по химической модификации ферментов (см., например: [2289, 22901) и многочисленными физико-химическими исследованиями [2291-22931.
Необходимо отметить, что различие в конформациях зимогена и фермента сказывается, по-видимому, в большей степени на активности в отношении специфических субстратов и в меньшей степени на активности в отношении "плохих” субстратов [2290,22941.
5.2. Влияние pH среды
Диапазан активности амидгидролаз охватывает интервал примерно в десять единиц pH. Внутри каждой группы ферментов область активности локализована в более узких пределах. Однако встречаются ферменты, функционирующие в области, далекой от оптимума pH для большинства представителей данной группы.
Исследования pH-зависимости кинетических констант ферментативного гидролиза и особенно констант скоростей индивидуальных стадий процесса дает важную информацию о характере групп фермента, участвуюших в связывании субстрата и его превращении, а также о механизме реакции (см. обзоры: И 613,
II 59,1661 1 ).
5.2.1. Кинетические законоиерности
Изменение констант скорости и равновесия фермент-субстратного взаимодействия обусловлены изменением состояния ионизации участвующих в этих взаимодействиях групп. В простейшем случае изменение pH приводит к протонированию или депротонированию по крайней мере двух ионизирующихся групп фермента, участвующих в катализе:
Если все три формы фермента (Е, ЕН й ЕН2) способны связывать субстрат, но химическое превращение происходит только с одним комплексом (например, EHS), то соответствующее выражение для скорости реакции будет:
