Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Суспензию клеток в версене собирают из матрасов в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10—15 минут при 1000 об/мин или же собирают в большие пробирки — размером 30x250 мм и оставляют на ночь при 4°. Надосадочную жидкость удаляют, полученный осадок ресуспендируют в питательной среде таким образом, чтобы 1 мл готовой суспензии содержал 100 000 клеток почек обезьян, а концентрацию остальных трех видов клеток берут в зависимости от предварительно определенной физиологической их активности, обычно по 75000— 300 000 клеток в I мл.
Для приготовления нужной концентрации количество имеющихся клеток подсчитывают в камере Горяева.
Суспензию клеток можно хранить при 4° в течение 3-х недель. Следует отметить, что питательную среду при этом необходимо менять каждые 5 дней. При хранении происходит отмирание части клеток и снижение физиологческой активности выживших, поэтому по мере хранения взвесей в реакции приходится брать большие концентрации клеток.
Вирус. Для титрования готовят 10-кратные разведения вируса на питательной среде.
Питательная среда. Для приготовления разведений вируса и суспензий клеток употребляют обычно 0,5% раствор гидролизата лактальбумина в растворе Хэнкса с 2% телячьей сыворотки, которую предварительно проверяют на отсутствие вируснейтра-лизующих антител или ингибиторов вируса. К среде прибавляют пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 рг/мл) и феноловый красный до 0,002%. Добавлением 7,5% раствора бикарбоната натрия или 3% уксусной кислоты pH среды доводят до 7,6—7,7,
Вазелиновое масло стерилизуют кипячением на водяной бане в течение 30 минут. Вазелиновое масло используют вместо пробки для запечатывания ингредиентов, внесенных в пробирку.
Постановка реакции. Для ориентировочного определения титра каждое разведение вируса вносят по 0,25 мл в 2 пробирки, в них прибавляют по 0,25 мл питательной среды и 0,25 мл взвеси клеток, содержащей одну дозу клеток, и по 0,5—0,8 мл стерильного вазелинового масла.
Параллельно ставят контроль дозы клеток для подтверждения правильности взятого в опыт количества клеток. Для этого в 2—3 рядах готовят двукратные разведения взвеси клегок, содержащие в 0,25 мл 1, ]/2 и l/i дозы клеток, и прибавляют по 0,5 мл питательной среды и по 0,5—0,8 мл вазелинового масла.
Пробирки ставят в термостат при 36—37° и учитывают на
5—7-е сутки, когда в пробирках с контролем дозы клеток изменяется цвет среды. Считают,' что доза клеток была взята правильно в том случае, когда в пробирках с полной дозой pH снижается до 6,8 (цвет ярко-желтый), в пробирках с 7г дозы цвет желтый или оранжево-розовый, а при У4 дозы клеток цвет среды остается красным. В тех случаях, когда в реакцию берут меньшее число клеток, реакцию удается учесть, увеличивая срок выдерживания пробирок в термостате до 12—14 суток. За такой продолжительный период клетки выделяют достаточное количество продуктов своей жизнедеятельности, способное изменить цвет среды. Когда берут большее количество клеток, чем следовало, пробирки удаляют из термостата и оставляют их при комнатной температуре. Этим замедляют процессы жизнедеятельности клеток, так как в среду продукты обмена поступают в меньшем количестве, и они не мешают нормальному ходу реакции. Кроме
этой манипуляции, для нейтрализации избыточных продуктов жизнедеятельности клеток рекомендуют добавлять в пробирки небольшое количество раствора щелочи.
В пробирках, где находится вирус, цвет среды остается красным. В тех пробирках, где цвет изменяется до оранжево-розового или желтого, вирус отсутствует.
Титрование антител в цветной реакции основано на том же принципе, что и титрование вируса. Для примера приведем реакцию, в которой титровались антитела к трем типам вируса полиомиелита.
Вирус. Используют стандартный вирус, предварительно оттитрованный в культуре ткани. При постановке реакции вирус разводят средой таким образом, чтобы в 0,25 мл содержалось 100 ТЦД50.
Таблица 19 Титрование вируса полиомиелита в цветной реакции (клетки почек обезьян)
Разведение вируса Титр вируса
Тип ю-1 10~2 10" а 10--4 10~5 10-0 10- 10-8
SHfjyca
I К к к к к ж . » I01'
К к к к к к *
11 К к к к к ж ж ж 10°
К к к к ж ж ж ж
III к к к к к к к ж
к к к к к к ж ж 10*
Контроль дозы клеток
Число клеток 1 доза дозы 1 4 ДОЗЫ
(25 000) (12 500) (6 250)
Результат Ж ор К
Ж ор К
Оботигчения: ж — желтый цвет среды; ор — оранжево-розовый цвет; к —красный цвет.
Сыворотка. Готовят двукратные разведения сыворотки и раз ливают по 0,25 мл в 6 параллельных рядов пробирок. Реакцию с каждым из трех типов вируса ставят в 2 рядах пробирок, содер-жащих соответствующие разведения сыворотки. Смесь выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего во все пробирки добавляют по 0,25 мл суспензии клеток и по
