Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Готовят 10-кратные разведения вируса в сбалансированном растворе Хэнкса или в питательной среде без сыворотки. При использовании среды с сывороткой последнюю предварительно проверяют на отсутствие антител или ингибиторов вируса полиомиелита. По 0,1 мл каждого разведения вируса вносят в 4 пробирки с растущей культурой клеток и добавляют 0,9 мл питательной среды 199 или другую. Рекомендуется доводить pH среды до 7,7— 7,8, что позволяет обходиться без смены среды в течение недели. Совершенно обязательно использовать среды с указанным pH при
работе с аттенуированными штаммами вируса полиомиелита, так как, по данным A. Ссбииа (Sabin, 1957), при более низких значениях pH, точнее меньшем содержании бикарбоната натрия, эти штаммы размножаются менее активно.
Некоторые авторы (Роббинс, Эндерс Уеллер, 1950) рекомендовали после внесения в пробирку вируса в объеме 0,1—0,2 мл осуществлять контакт инфекционного материала с клетками в течение 30—60 минут, после чего в пробирки вносят 0,8—0,9 мл питательной среды. Однако в дальнейшем было показано, что адсорбция вируса клетками происходит достаточно быстро и поэтому предварительный контакт вируса с клетками является излишним.
В каждом опыте титрования вируса не менее четырех пробирок с клетками оставляли для контроля ткани и в эти пробирки добавляли 1 мл питательной среды без вируса. Известно, что иногда имеет место так называемая неспецифическая дегенерация незаряженных культур вследствие плохой обработки стекла, токсичности используемой среды и т. д. Кроме того, разрушение клеток может быть обусловлено латентными вирусами, нередко присутствующими щ первичных культурах тканей животных. Все пробирки укладывают под углом в 5° на специальные лотки или штативы и помещают в термостат при 36—37°.
На результаты титрования может оказывать большое влияние степень чувствительности культуры к вирусу. Поэтому в качестве второго контроля рекомендуют производить параллельное титрование стандартного вируса с заранее известным титром, который хранят при температуре—20° и ниже.
На следующий день после инокуляции пробирки с культурами просматривают при малом увеличении микроскопа. Если при контроле на жизнеспособность ткани обнаруживают признаки неспецифической дегенерации, опыт повторяют.
Срок появления цитопатогенных изменений зависит от дозы нируса. При инокуляции 1000 ТЦД50 и более дегенерация наступает через 24—48 часов. При небольших дозах вируса (1—10 ТЦД50) клеточный слой разрушается на 5—7-е сутки. Большинство исследователей производят окончательный учет результатов в указанные сроки. Однако при изучении динамики инактивации вируса полиомиелита под действием формалина при изготовлении инактивированной полиомиелитной вакцины рекомендуют увеличить период наблюдения за культурами до 10—14 дней. По мнению Тейлора, Кэя и др. (Tayler, Kay et aL, 1957) частицы вируса полиомиелита, имевшие контакт с формальдегидом, но не утратившие при этом свою жизнеспособность, вызывают цитопатоген-ные изменения в более поздние сроки.
Титром вируса считают то наибольшее его разведение, которое при введении в пробирки с культурой ткани вызывает дегенерацию 50% культур. Титр вируса обычно вычисляют по методу Ри да и Менча или Кербера.
Титрование вируса полиомиелита трех типов в культуре ткани клеток
почки обезьяны
Тип Рзаведение вируса i
10-1 10 “2 10 ~3 № * 10-5 io- 6 io-' 10- K
1 т + ! _j_ "Г Г -i - : -г -J- -i i --- --- 10е
+ 4 ! - -! - + -!
И -м - 4 I- + _j -j. ¦i- Г --- --- --- 10s-6
г 4 -Г -1 1 _ ’4
1 :
III + -г- _|. -1 _Х„ . + -i- “i- + 1 --- --- I06’s
-i-f _L. -1- -i- r + 4
Обозначения. + ;и генерация клеток; — отсутствие дегеиерашш.
Для примера приводим протокол опыта титрования вируса {табл. 13). Данные таблицы показывают, что под воздействием вируса типа I дегенерация клеток наступила во всех пробирках, зараженных разведениями вируса 10—Ю~2, 10~3,
10-4, 10~'\ а при разведении 10~6 цитопатогенное действие отмечено в 2 пробирках из 4. При вычислении титр вируса определен в 106, соответственно титры вируса II типа равняются 10 г,'г’ и вируса III типа—1065 в 0,1 мл исследуемого материала.
У Методика титрования вирусов на однослойных культурах су-/щественно не отличается от изложенной выше.
\ Своеобразную методику титрования вирусов полиомиелита на культурах клеток КВ предложили Лепин, Самей и др. (Lepine, Samaille et al., 1960). Разведения вируса готовят на буферном растворе. В серологические пробирки вносят 0,45 мл соответствующего разведения вируса, а затем добавляют 25000 клеток КВ в среде с гидролизатом казеина в объеме 0,5 мл и 0,5 мл вазелинового масла. Пробирки помещают в штативы и инкубируют в вертикальном положении в течение 7 дней при 37°. Через 7 дней пробирки просматривают под микроскопом. О цитопатогенном действии вируса судят по лизису клеток, расположенных на дне пробирки. По мнению Ленина и др. (1960), в описанном методе сочетаются достоинства цветной пробы (непосредственное использование клеточной взвеси без предварительного культивирования в пробирках) и техники титрования вируса по цитопатогенному действию (учет результатов по деструкции клеток).