Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Первые признаки цитопатогенного действия вируса отмечали через 24—48 часов после заражения, полпая деструкция клеток наступала на 5—7-е сутки.
При сравнительном титровании вируса весенне-летнего клещевого энцефалита на культурах кожно-мышечной ткани человека
и на белых мышах, которых заражали в головной мозг, были получены одинаковые значения LDso и ТЦД50.
Е. Н. Левкович и Г. Д. Засухина (1959) предложили использовать феномен гашения цитопатогенного действия вируса весенне-летнего клещевого энцефалита в культурах фибробластов человека для обнаружения нейтрализующих антител в сыворотках людей и животных. Для этого равные объемы двукратных раз-ведений сыворотки, приготовленных на физиологическом растворе, соединяли с суспензией мозга мышей или культуральной жидкостью, содержащей 100 ТЦД50 вируса. После часового контакта смесь вносили в пробирки с культурой ткани. Результаты опыта учитывали на 3—4-е сутки.
Нельзя не привести, однако, данных, полученных Данешем (1957). В опытах на культурах ткани эмбриона человека ему не удалось наблюдать сколько-нибудь четкого и постоянного цитопатогенного действия вируса весенне-летнего клещевого энцефалита.
Иванович, Кох и Ксери-Пехани (Ivanovics, Koch, Cserey-Pe-chany, 1956) использовали плазмированные культуры кусочков сердца куриных эмбрионов для титрования вируса болезни Ауески (псевдобешенства). Зинкович (Sinkovics, 1956) брал для титрования вируса простого герпеса аналогичные культуры кусочков ткани эмбриона человека.
Зейферт (Seifert, 1956) разработал своеобразную модификацию рассматриваемого метода. Кожно-мышечные ткани куриного эмбриона в возрасте 5—9 дней нарезают ножницами на мелкие кусочки, промывают их раствором Тироде, после чего переносят в короткие пробирки и тщательно измельчают короткими ножницами. Полученную таким образом взвесь мелких кусочков эмбриона ресуспендировали в питательной среде. Питательную среду добавляют из расчета 2 мл на один эмбрион. По 1 мл этой взвеси разливали по пробиркам, а затем вносили по 1 мл питательной среды. Пробирки в слегка наклонном положении помещали в термостат при 37°. На 3—4-й день на нижней стенке пробирок образовывался сплошной слой фибробластов.
На культурах такого типа Зейферт выделял, культивировал и идентифицировал вирус чумы кур.
Тамм, Фолькерс и Хорсфолл (Ташш, Folkers, Horsfoll, 1953) предложили титровать антитела к вирусу гриппа на культурах переживающих кусочков хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона. Л. Я. Закстельская (1957) несколько упростила эту методику. Скорлупу 11—15-дневного эмбриона тщательно обрабатывают спиртом, обжигают скорлупу в области скорлупного мешка и тело эмбриона удаляют вместе с желтком и белком таким образом, чтобы часть хорионаллантоисной оболочки оставалась внутри яйца. Затем скорлупу вместе с оболочкой нарезают на кусочки размером 2 см и помещают их в чашку Петри с физиологическим раствором. Оболочку отделяют от скорлупы, промывают в рас-твопе Хэнкса и переносят в пробирки с раствором Хэнкса (рН7,4—
7,6), содержащим по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина. Приготовляют возрастающие 10-кратные разведения вируса. В пробирку вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки, а затем по 0,1 мл соответствующего разведения вируса. Пробирки помещают во вращающийся барабан, который движется со скоростью 12 об/час. Через 48 часов пробирки просматривают. Пережившие кусочки имеют прозрачный вид, среда, в которую они погружены, сохраняет малиновый цвет. При гибели тканевые кусочки становятся мутными, а среда приобретает желтую окраску. В пробирку с пережившими кусочками добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур. Штативы встряхивают и по рисунку осевших эритроцитов определяют наличие или отсутствие гемагглютининов, т. е. вируса.
Наименьшее разведение вируса, внесение которого в пробирки приводит к накоплению гемагглютининов, принимают за его титр. Нейтрализующую активность сыворотки выражают в виде индекса нейтрализации.
i ' ;< •'
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ОДНОСЛОЙНЫХ КУЛЬТУРАХ
Титрование вирусов в однослойных культурах тканей в настоящее время является одним из основных методов их количественного определения. Впервые однослойные культуры почечных клеток обезьян для титрования вирусов полиомиелита были предложены Янгнером (1954). Вскоре было показано, что использование однослойных культур позволяет обнаружить цитопатогенные свойства у вирусов ECHO и Коксаки, группы осповакцины, у герпетических вирусов, у многих трансмиссивных вирусов, аденовирусов, кори и др.
Титрование различных вирусов в однослойных культурах производится в общем по сходной методике, В качестве примера приведем схему титрования вируса полиомиелита. Производят отбор пробирок с однослойными культурами почечных клеток. При этом важно, чтобы клетки имели нормальную морфологию и не обнаруживали признаков неспецифической дегенерации. Нет необходимости использовать только культуры со сплошным монослоем. В опыт можно брать также пробирки, в которых клеточные островки занимают не менее 75% поля зрения. Из пробирок удаляют питательную среду и затем вносят определенный объем, обычно 0,1 мл, соответствующего разведения вируса.