Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Сходные результаты были получены Бангом, Леви и Геем (Bang, Levy, Gey, 1951) с вирусом оспы птиц. В зараженной культуре фибробластов куриного эмбриона репродукция вируса наблюдалась в течение 120 дней без каких-либо внешних признаков поражения клеток.
Клетки, обладающие повышенной резистентностью к цитопато-генному действию вируса, могут быть получены воздействием больших количеств вируса на популяцию данного штамма клеток.
В ряде случаев выжившие резистентные клетки размножаются, будучи инфицированными без проявления нитопатогенного эффекта. Так, из линии S3 клеток HeLa, несколько раз в процессе пассажей заражавшихся вирусом полиомиелита типа III (Фогт, Делбекко, 1958), была получена культура с повышенной резистентностью.
Гейле и др. (Henle, Deinhardt, 1957: Deinhardt, Bergs, Henle,
1958), используя штамм перевиваемых клеток (MCN), выделенный из костного мозга, установили длительную переживающую инфекцию вирусов ньюкаслской болезни и свинки. Эти вирусы размножались в клетках, не разрушая их. Инфицированные клетки отличались от контрольных уменьшением скорости роста, увеличением аэробного гликолиза и резистентностью к заражению вирусами везикулярного стоматита, герпеса простого и гриппа А, Эти изменения свойств клеток не были генетическими и чистые, незаряженные линии клеток, выделенные из латентно инфицированных культур, полностью ^восстанавливали свою чувствительность к указанным вирусам. Как было установлено, в латентно инфицированных культурах лишь 1 из 50 или 100 клеток была способна поддержать размножение вируса. Латентную форму инфекции клеток HeLa вирусом Коксаки А-9 описали Такемото и Габель (1959). Авторы отмечают, что причиной длительной инфекции культур-носителей является относительная нечувствительность клеток HeLa к вирусу Коксаки А-9, особенно если клетки, находятся в состоянии высокой метаболической активности в богатой питательной среде. Важным моментом является также отсутствие накопления большого количества вируса в культуре вследствие быстрой тепловой инактивации вируса в условиях, когда размножение его идет с относительно небольшой скоростью.
О. Г. Анджапаридзе и Н. Н. Богомолова (1961) изучали в культурах клеток Нер-2 латентную инфекцию, вызванную вирусом клещевого энцефалита. Клетки были инфицированы вирусом весеннелетнего клещевого энцефалита штамма «Софьин». Одномоментно с засевом 1,5 млн. клеток в 250 мл матрас Повитской был введен вирус в количестве I09 LDeo в виде 10% суспензии мозга зараженных мышей. Таким образом, на одну клетку пришлось 666 LD50 вируса. Культивирование однократно инфицированных клеток велось в среде 199 с 10% бычьей сыворотки, в которой отсутствовали антитела к вирусу весенне-летнего клещевого энцефалита или определяемые ингибиторы.
Пассажи клеток проводили по общепринятой методике для культивирования перевиваемых штаммов, в среднем 1 раз в 8—12 дней.
Контроль за состоянием клеток осуществлялся путем микро-г-кппнппкяния Kv.7ibTvobi под малым увеличением. Для определе-
ния наличия вируса в питательной среде и в клетках перед очередным пассажем клеток брали пробу питательной среды. Затем всю питательную среду удаляли, клетки снимали версеном, центрифугировали, разводили новой питательной средой в объеме, равном количеству среды, удаленной из матраса. Клетки подсчитывали, часть их использовали для следующего пассажа, другую часть замораживали. Пробу питательной среды центрифугировали и также хранили при температуре ниже нуля. Наличие вируса в пробах определяли внутримозговым титрованием на мышах. Результаты обрабатывали по методу Рида и Менча.
Однократно инфицированные вирусом клетки Нер-2 прошли на протяжении 17 месяцев 44 пассажа. В течение всего времени культивирования клеток не было отмечено явлений их специфической дегенерации.
Кратность прироста клеток в инфицированных культурах на протяжении 27 пассажей колебалась от 1,2 до 8. При пассажах зараженных клеток в первые сутки культивирования отмечалось отставание их в росте по сравнению с контрольными культурами. Обращает внимание меньшая активность роста инфицированных клеток по сравнению с контрольными в первые 10 суток культивирования. Однако к 12-м суткам количество выросших клеток в латентно инфицированных и контрольных культурах уравнивалось. ^
В отличие от контрольных клеток Нер-2, быстро образующих сплошной пласт и имеющих по периферии очага роста много вытянутых и полигональных форм, клетки латентно зараженных культур растут в виде островков, вытянутые формы клеток по периферии островка отсутствуют. Морфологические исследования латентно инфицированных культур показали значительное увеличение эозинофильных включений по сравнению с контролями и наличие большого количества многоядерных гигантских клеток. Митотическая активность нормальных и зараженных клеток была одинаковой и равнялась 27 делящимся клеткам на тысячу сосчитанных.
Для определения степени зараженности культур были измерены ядра клеток латентно инфицированных культур 12-го и 14-го пассажа. Средние величины ядер оказались равны 107,9 и 109 планиметрических единиц соответственно, в то время как средние величины ядер клеток в контрольных культурах равнялись 85,5 и 87. Расчеты определили, что около одной трети клеток культур инфицировано вирусом. На протяжении всех пассажей однократно зараженных клеток Нер-2 имелась репродукция вируса весенне-летнего клещевого энцефалита.
