Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Ховес (1659а, б) опубликовал результаты своих дальнейших исследований процессов размножения вируса полиомиелита в клетках. Эти исследования проводились на перевиваемых культурам клеток HeLa, ERK и в первичной культуре клеток почки обезьян. Процесс развития инфекции изучали как в клетках, суспендированных в питательной среде, так и в отдельных, изолированных клетках. Последние исследования представляют особый интерес
Ховес считает, что изучение процессов размножения вируса в клетках однослойных культур не может дать достаточно точных результатов, отражающих действительно протекающий процесс инфекции. По его мнению, это связано с тем, что в однослойных культурах происходит реадсорбция клетками свободного вируса, что искажает получаемые исследователями результаты. Использование культур клеток, суспендированных в питательной среде, позволяет получать более точные результаты.
В связи с тем что эти работы имеют большое значение как е теоретическом, так и в методическом отношении, их необходимо изложить подробнее.
Однослойные культуры клеток почек обезьян готовили путем обычной трипсинизации. Клетки культивировали в 0,5% растворе гидролизата лактальбумина с 5% телячьей сыворотки. Штаммы перевиваемых клеток ERK и HeLa культивировали в среде Игла с 15% телячьей сыворотки.
Клетки культивировали в чашках Петри (диаметр 50 мм), В опытах был использован 1 тип вируса полиомиелита штамм Брунгильда. Титрование вируса проводили на однослойной культуре клеток почки обезьян методом бляшек по Делбекко. Разведения вируса готовили на фосфатнобуферном растворе. Культуры заражали в дозе 0,3 или 0,5 мл соответствующего разведения вируса. Однослойные культуры клеток перед заражением однократно отмывали фосфатнобуферным раствором. Вирус удаляли и? культур после 30 минут адсорбции при 37°, затем однослойные культуры заливали 5 мл агарового покрытия, подогретого до 43— 45°. Культуры инкубировали при 37° в смеси воздуха с 5% СОг Бляшки становились заметными через 2—4 дня.
Агаровое покрытие состояло из 1 % агара, солевого растворе Эрла с 0,2% глюкозы, нейтрального красного (1:30000), 5% кроличьей сыворотки и антибиотиков. Солевая среда предварительно насыщалась СО2 до интенсивно красного цвета.
Суспензию инфицированных клеток готовили следующим образом. Выросшую однослойную культуру клеток отмывали один раз фосфатнобуферным раствором. В культуру вносили 0,5 мл вируса, разведенного в фосфатнобуферном растворе так, чтобы можно было получить множественную инфекцию клеток. Вирус адсорбировали 30 минут при 37°, после чего культуру 3—4 раза отмывали фосфатнобуферным раствором и один раз фосфатнобуферным раствором, не содержащим солей кальция и магния. После этого две чашки Петри с культурой клеток для определения средней множественности инфекции бляшками по Делбекко покрывали агаром, а основную часть клеток однослойной культуры снимали со стекла 0,25% раствором трипсина или 0,02% раствором версена, не содержащим солей кальция и магния. При таких условиях за 10 минут снимали свыше 80% клеток. Снятые клетки для освобождения от раствора трипсина или версена центрифугировали в питательной среде. Для получения гомогенной взвеси культуру диспергировали пипетированием. В некоторых опытах брали взвеси клеток для определения числа зараженных клеток.
Концентрацию клеток в суспензии подсчитывали и доводили до Ю4 или 5 X Ю4 в 1 мл. Суспензию клеток помещали в колбы Эр-ленмейера, вводили смесь 5% С02 с воздухом и инкубировали при 37°. Клетки поддерживали в суспендированном состоянии слабым перемешиванием магнитной мешалкой.
Через определенные интервалы из колб брали по две пробы. Одну пробу немедленно замораживали в смеси сухого льда со спиртом; она служила для определения общего вируса, т. е. вируса, связанного с клетками, и вируса, присутствующего в питательной среде. Другую пробу предварительным центрифугированием в течение 3 минут при 1500 об/мин освобождали от клеток и надосадочную жидкость исследовали для определения свободного вируса, т. е. вируса, присутствующего только в питательной среде.
Предварительными опытами было показано, что для освобождения из клеток вируса, связанного с ними, может быть применено однократное замораживание и оттаивание или воздействие в течение 30 минут ультразвуком (20 кгц). В основных опытах был использован первый метод, так как процедура замораживания и оттаивания не влияла на число активных вирусных частиц.
Средняя множественность инфекции или среднее число инфекционных вирусных частиц, которые адсорбировались на одну клетку, определялись числом образующихся бляшек.
Для определения числа инфицированных клеток на питательной среде готовили большие разведения взятой пробы суспензии клеток. По 0,5 мл этих разведений клеток смешивали с 1 мл агарового покрытия. Смеси вносили в чашки Петри с однослойной культурой клеток, затем эти культуры заливали по 4 мл обычного агарового покрытия. Благодаря такому приему вносимые клетки фиксировались в слое агара на небольшом расстоянии от одно-
