Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Взвеси клеток замораживали в специальных аппаратах, позволяющих регулировать скорость понижения температуры. Замораживание проводили путем снижения температуры на 1° ,в минуту до температуры —25°. Затем замороженные суспензии переносили в ящики с термоизоляцией и сухим льдом, дающие температуру —75 ±2°.
Замороженные клетки перед употреблением оттаивали в проточной воде температурой 37°. После оттаивания подсчитывали число клеток во взвеси.
Взвесь клеток разводили средой Игла, содержащей 5% телячьей сыворотки. В пробирки для культивирования вносили 150 000 клеток в 1 мл среды, а в чашки Петри— 1 500 000 клеток в 7 мл среды. При культивировании клеток в чашках Петри последние содержали в атмосфере с 5% углекислоты.
Питательную среду при культивировании клеток трипсинизиро-ванной почечной ткани меняли на 6-й или 7-й день, а при культивировании первичных культур, обработанных версеном,— на 2-й или 3-й день.
В большинстве случаев хранение клеток в замороженном состоянии приводило к гибели части клеток. Процент клеток, погибающих от этой процедуры, ,в 25 опытах колебался для трипсинизированных клеток от 30 до 31, а для версенизированных— от 0 до 25.
Отмечалось некоторое, примерно на одни сутки, отставание в скорости роста клеток, которые до этого хранили при минусовой температуре по сравнению с контрольными. Однако указанное обстоятельство не отражалось на образовании монослоя.
Культуры, выращенные из замороженных клеток, полностью сохранили свою чувствительность. Чувствительность этих культур была испытана к вирусам полиомиелита I, II и III типа, Коксаки В (1—5 типы), ECHO {1 —19 типы), аденовирусу-7, вирусам гриппа, кори и др.
При сравнительном титровании различных вирусов (гриппа, полиомиелита, кори, аденовирусов и др.) на культурах замороженных и незамороженных клеток показана одинаковая чувствительность этих клеток к испытанным вирусам.
Была продемонстрирована равная чувствительность незамороженных клеток и клеток, хранившихся в замороженном состоянии, при использовании этих культур в параллельных опытах выделения вирусов полиомиелита, Коксаки и ECHO из образцов фекалий и вирусов Коксаки из спинномозговой жидкости людей.
Положительные результаты были получены К. С. Куликовой (1959, 1961), изучавшей выживаемость при низких температурах клеток, взятых не в виде взвеси, а в виде однослойных культур. Охлаждению подвергали растущие культуры перевиваемых клеток разного происхождения после 3—7 дней культивирования (HeLa, Hep-1, Hep-2, КВ, J-96, Детройт-6, СОЦ и др.).
В качестве защитных сред использовали глицерин (2, 5, 10, 50%), этиленгликоль (2, 5, 10%), метанол (0,1; 1, 3,5%), коровью сыворотку, сахарозу и некоторые другие. Указанные ингредиенты добавляли перед замораживанием в различных концентрациях и сочетаниях к среде 199 с 10% коровьей сыворотки, на которой производили культивирование.
К. С. Куликова установила, что культуры, подвергнутые замораживанию при температуре —45° и хранению при этой температуре, а затем быстрому оттаиванию в термостате при +37°, при консервировании с защитными средами сохраняют жизнеспособность от 1—3 до 5—6 месяцев.
Наилучшей защитной способностью обладали глицерин и эти-ленгликоль в 10% концентрации; снижение или увеличение их концентрации приводило к значительной гибели клеток. Другие, перечисленные выше, среды при их использовании давали менее благоприятные результаты. В культурах, замороженных без добавления как защитной, так и питательной среды, выживаемость клеток была низкая.
Замороженные тканевые культуры при пассировании быстро восстанавливали способность к размножению. Потенции роста клеток после охлаждения (II и III генерации) были такими же, как и у незамороженных клеток.
Изученные культуры II и III генерации после замораживания сохранили исходную чувствительность к трем типам вируса полиомиелита.
Скорость замораживания клеточных взвесей, температура их хранения и включение в среду глицерина в качестве вещества, связывающего внутриклеточную воду, являются существенными факторами, влияющими на сохранение жизнеспособности клеток.
Общепризнано, что оптимальной скоростью замораживания является 1° в минуту до температуры —25° и хранение при температуре —70°.
Однако имеются некоторые разногласия по поводу оптимальной концентрации глицерина для защиты клеток. Для ряда штаммов клеток и первичных трипсинизированных культур содержание 5|% глицерина р. среде является оптимальным, тогда как для других она не создает достаточной защиты.
Хранение клеток при низкой температуре в течение длительного времени при соблюдении оптимальных условий практически не меняет их основных культуральных свойств и чувствительности к вирусам.
ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУР ТКАНЕЙ В ИЗУЧЕНИИ ВИРУСОВ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ И ВОСПРИИМЧИВЫХ КЛЕТОК IN VITRO
РЕАКЦИЯ КЛЕТОК НА ВИРУСНУЮ ИНФЕКЦИЮ
Встреча вирусов с восприимчивыми клетками в культуре тканей в зависимости от степени чувствительности последних к вирусу и условий среды может привести к развитию либо острой формы инфекции, либо латентной инфекции.
