Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Описанная выше модифицированная среда Игла с 10% лошадиной сыворотки была использована для глубинного культивирования клеток стабильных штаммов HeLa, L, ERK/KD. Однако в этих опытах культивирование проводили в 20-литровых реакторах.
Реактор и все детали, соприкасающиеся с жидкой культурой, были изготовлены из нержавеющей стали марки 316, являющейся нетоксичной для клеток млекопитающих.
Для перемешивания взвеси клеток использовали шестилопастную мешалку. Перемешивание в зависимости от объема среды проводилось со скоростью 140—190 об/мин и регулировалось по вспениванию среды.
Аэрацию глубинных культур не производили, так как она ком пенсировалась повышенной концентрацией в питательной сред< фосфатнобуферного раствора.
Нужную для культивирования клеток температуру в 36—37 поддерживали циркуляцией подогретой -воды в водяной рубалш реактора.
В процессе глубинного выращивания клеток питательную сред} не меняли. Было достаточно периодического добавления к сред< аминокислот или одного аргинина. При этих условиях нормаль ная пролиферация клеток поддерживалась в течение 10—20 дней Каждый из исследуемых клеточных штаммов поддерживали I виде однослойной культуры в матрасах. Посевной материал дл? 20-литровых реакторов получали путем промежуточного глубин ного культивирования этих клеток в 3-литровых реакторах.
При культивировании в 20-литровых реакторах в них вносил* 1,7—3* 105 клеток в 1 мл в 6 л питательной среды.
В процессе культивирования брали пробы, подсчитывали числс клеток и определяли их жизнеспособность витальным окрашива нием трипановой синью.
Ниже подробнее приводятся результаты, полученные этим!-авторами при культивировании клеток.
Для культивирования клеток штамма L в 20-литровый реактор в 6 л питательной среды было внесено 1,47 • 10е клето* (2,45* Ю5 в 1 мл). Через 4 дня роста взвесь содержала примернс
4 • 105 клеток в 1 мл и было добавлено еще 6 л питательной среды Постоянное увеличение числа клеток наблюдалось свыше 7 дней За этот период в реактор трижды добавляли концентраты аминокислот среды Игла.
После 11 дней роста концентрация клеток достигла 6,75 • 10! в 1 мл .в 12 л взвеси.
С целью замены питательной среды 12 л клеточной взвеси было извлечено из реактора, отцентрифугировано и ресуспендирова но в свежей питательной среде. Взвесь клеток была разделенг на два 20-литровых реактора. Общий объем взвеси в каждом и; двух реакторов был равен 6 л. Через 5 дней в каждый реактор было добавлено по 6 л свежей среды. В дальнейшем в один реактор была добавлена смесь аминокислот, входящих в состав средь Игла, а в другой — только аргинин. В каждом случае количестве добавляемых аминокислот и аргинина соответствовало содержанию их в свежей питательной среде. Рост клеток в обоих реакторах был почти одинаков.
В результате такого культивирования при засеве 1,47 • 10® клеток было получено до 30- 10й клеток в 24 л питательной среды Культивирование клеток HeLa принципиально мало чем отли чалось от описанного выше глубинного выращивания клеток L Культивирование клеток HeLa продолжалось более 11 дне? и за весь период клеточная популяция возросла с 2,8 ¦ 10s клето*
-in 10 fi . If)9 КЛРТПК R II Л ГПРПЫ
При культивировании клетОк штамма ERK/KD в большой реактор было внесено 5,6- 105 в 1 мл клеток в 6 л питательной среды. Данная культура, так же как и предыдущие, поддерживалась периодическим добавлением свежей среды и аргинина. Это позволило продолжать культивирование клеток без смены среды в течение 10 дней.
При добавлении аргинина и свежей среды за 6 дней роста клеточная популяция увеличилась с 3,4- 109 до 11,1 ¦ 109 клеток.
Таким образом, три стабильных перевиваемых штамма клеток успешно культивировались в больших объемах. Наблюдалось
3—6-кратное увеличение числа клеток за 6—12-дневный период глубинного выращивания.
Уолэс и Кокс (Wallace, Сох, 1959) изучили рост во взвешенном состоянии клеток линий MCN, Нер-1 и HeLa. Эти клетки культивировали в среде, состоящей из 30% лошадиной или телячьей сыворотки и 70% 0,5% раствора гидролизата лактальбумина в растворе Эрла.
Культивирование проводили в стеклянных 1-, 2- и 5-литровых бутылях при 37°. Сосуды закрывали резиновыми пробками с вводом и отводом для пропускания воздуха, насыщенного 5% С02. Газирование достигали пропусканием через сосуд примерно 140 мл/час газа. Одно-и двухлитровые бутыли засевали 100—300 мл суспензии, содержащей 300 000 клеток в 1 мл.
В процессе культивирования питательную среду периодически меняли на несколько большее количество свежей среды. Увеличение объема сменяемой среды проводилось медленно и не превышало 300—400 мл на каждую однолитровую и 600—800 мл на каждую двухлитровую бутыль. Когда в максимальном объеме среды темп роста клеток начинал замедляться, из бутылей удаляли половину клеточной популяции или всю клеточную популяцию переносили в 9-литровую бутыль. В 9-литровые бутыли вносили по 1 л среды, содержащей не менее 300 000 клеток в 1 мл. При последующих сменах среды этот объем увеличивали максимально до 3 л. Питательную среду при глубинном культивировании клеток меняли 2 раза в неделю. Старую питательную среду меняли путем отделения ее от клеток центрифугированием и ресуспендированием клеток в свежей питательной среде.
