Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Анджапаридзе О.Г. -> "Культура ткани в вирусологических исследованиях" -> 42

Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.

Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях — Москва, 1962. — 207 c.
Скачать (прямая ссылка): kulturarkani1962.djvu
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 101 >> Следующая

ток к стеклу происходит благодаря секреции ими клейкого белкового вещества, на которое и действует раствор версена. В зависимости от способности клеток продуцировать указанное склеивающее вещество продолжительность процесса отделения клеток от стекла под действием раствора версена (версенизация) варьирует от одного штамма клеток к другому, но обычно не превышает 15—20 минут. Для ускорения этого процесса сосуды с клетками и версеном .время от времени необходимо слегка .встряхивать.
После того как клетки отделились от поверхности стекла, их переносят в центрифужные пробирки или стаканы (в зависимости от объема клеточной взвеси). Клетки осаждают центрифугированием при 1500—2000 об/мин .в течение 7—10 минут. Надосадочный слой версена удаляют, клеточный осадок повторным пипетирова-нием переводят в гомогенную взвесь .в небольшом объеме среды для выращивания клеток. Затем отбирают небольшую пробу взвеси для установления концентрации клеток с помощью счетной камеры. Зная исходное число клеток в 1 мл и общий объем, в котором они содержатся, добавлением питательной среды можно довести концентрацию клеток в единице объема до требуемой.
Обычно для получения пробирочных культур в пробирки вносят взвеси, содержащие от 50 000 до 200 000 клеток в 1 мл. Указанные колебания концентрации клеток в среде перед посевом зависят от потенции размножения данной линии перевиваемых клеток. Пробирки с клетками герметически закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при 36—37° в слегка наклонном положении. Конец пробирки, закрытый пробкой, должен находиться выше противоположного конца, к которому стекает клеточная взвесь.
Клетки, осев на поверхность стекла, прикрепляются к нему (часто очень быстро, в течение нескольких часов). При просмотре пробирок под микроскопом уже на другой день можно наблюдать образование островков в результате размножения прикрепившихся клеток. Размеры островков постепенно увеличиваются, далее они сливаются, образуя сплошной слой. Обычно это происходит на 2—5-й день после посева клеточной взвеси. Продолжительность инкубации зависит в основном от индивидуальных особенностей динамики размножения различных линий перевиваемых клеток.
Корриел, Мак Аллистер, Грин, Флэг, Толл и Вагнер пользовались следующей методикой культивирования клеток СОЦ, выведенных из сердца обезьяны макаки-циномольгус. Для выращивания клеток использовали среду 199, содержащую 10% нормальной телячьей сыворотки. pH среды доводили до 7,6 добавлением раствора ЫаНСОз- После культивирования в течение недели число клеток увеличивалось в 8—10 раз. На этой стадии производили пересев клеток, для чего пользовались 0,125% раствором трипсина или 0,25% раствором версена. Клетки, отделившиеся от поверхности стекла и взвешенные в растворе трипсина или версена, осаждали центрифугированием, а затем после удаления надосадочной
жидкости ресуспендировали в свежей среде. Полученного «урожая» клеток было достаточно для пересева в 4 стеклянных сосуда такого же типа, на котором они были выращены.
Авторы отмечают, что клетки СОЦ росли одинаково хорошо при добавлении к среде как телячьей, так и лошадиной сыворотки, но значительно хуже при использовании кроличьей сыворотки. Хорошее размножение клеток наблюдали также при использовании 0,5% раствора гидролизата лактальбумина в растворе Эрла с добавлением 0,1% дрожжевого экстракта Дифко. По данным авторов, клетки СОЦ по скорости своего размножения не уступали штамму раковых клеток HeLa, культивируемому на среде 199, содержащей 20% сыворотки человека. Митотический индекс клеток СОЦ на 4—7-й день культивирования составлял 44 (на 1000 клеток).
При отсутствии синтетической среды и дефицитной сыворотки человека целесообразно обращаться к использованию линий перевиваемых клеток, адаптированных к размножению в среде, содержащей некоторые естественные ингредиенты и животную сыворотку. Так, например, Жачеку удалось адаптировать столь требовательный клеточный штамм, как раковые клетки HeLa, к выращиванию в относительно простой среде (40% нормальной лошадиной сыворотки, 50% раствора Хэнкса и 10% коровьего эмбрионального экстракта).
При посеве в пробирки оптимальных концентраций этой линии клеток HeLa обильный рост наблюдался после 4—5-дневной инкубации.
Эндерс (1957) и Шерер, Сивертон (1953) рекомендуют пользоваться для перевивок клеток HeLa комбинацией механического способа с трипсинизацией или только механическим способом. В первом случае при хорошем росте клеток клеточный пласт отделяют от поверхности стекла с 'Помощью изогнутой стеклянной палочки. Пленку помещают на 90 минут в 0,5% раствор трипсина при 37°, после чего взвесь встряхивают для лучшего диспергирования клеток. Клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин, ресуспендируют в культуральной среде до концентрации клеток 100 000 в 1 мл. Полученную взвесь разливают по пробиркам (по 0,5—1,5 мл).
Механический способ сводится к простому соскабливанию клеточного слоя со стенки стеклянного сосуда. Клеточную пленку нарезают на мелкие кусочки. Через 10 минут после нанесения таких кусочков на стенку пробирок, предварительно смоченную культуральной средой, эти фрагменты пленки достаточно хорошо прикрепляются к стеклу, чтобы можно было внести в пробирки культуральную среду в обычном объеме.
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 101 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed