Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Убедительные данные в .пользу предположения, что первопричиной подобных изменений клеточных штаммов может 'быть неоднородность клеточной популяции, были получены Паком и Фишером (Puck, Fischer, 1956) с помощью метода выделения чистых клональных линий, происходящих из отдельных клеток. На характеристике самого метода мы остановимся ниже. Из состава родительской популяции клеток HeLa авторы .выделили два чистых клональных штамма Si и S3. В морфологическом отношении клетки указанных клональных штаммов не отличались друг oi друга и от родительской популяции, однако обладали различной потенцией размножения. Штамм Si обладал значительно меньшек активностью клонообразования при посеве по методу Пака v. Маркуса по сравнению со штаммом S3, у которого показатель характеризующий это свойство, составлял около 100%. При боле< низких концентрациях сыворотки человека в культуральной средс (15—10,%) клетки Si совсем не образовывали клонов, тогда кат все 100% клеток S3 при этих условиях размножались, образу5 колонии. Последующий анализ показал, что обнаруженные различия в активности клонообразования определяются генетическими факторами и передаются по наследству от генерации к ге нерации.
Лейди и сотрудникам (Leidy, Sprunt, Redman, Alexander, 1959; удалось 'Получить клональные линии клеток HeLa, как более чув ствительные, так и более резистентные к вирусу полиомиелитг по сравнению с обычной лабораторной линией этих клеток.
Накопление фактов, подобных приведенным выше, привело ис следователей к убеждению, что перевиваемые клеточные линш далеко не всегда «стабильны» в своих свойствах и что измененш характера клеточной популяции может быть связано с изменением условий культивирования (состав питательной среды, концентра ция засеваемых клеток, -видовая принадлежность и концентрацш сывороточного компонента и т. д.). По-видимому, несовпаденш результатов изучения чувствительности одних и тех же клеточны: линий к некоторым вирусам, проводившегося разными авторами в значительной мере следует отнести за счет известной «дивер генции» подштаммов одного и того же штамма, поддерживаемы: в разных лабораториях, хотя все они носят одно и то же найме нование.
Иллюстрацией к сказанному может служить получение вариантов линий перевиваемых клеток при изменении состава культуральной среды, используемой для их выращивания, Хэфф и Суим (1957) описали получение варианта линии перевиваемых фибро-бластов кролика, который отличается от родительского штамма тем, что хорошо размножался в среде с 3% диализованной сыворотки. Для размножения клеток родительского штамма была необходима среда, содержащая 10% нативной сыворотки. Вот почему возникло требование строгой стандартизации всех условий культивирования клеточных штаммов, используемых для проведения вирусологических исследований. Только в этом случае можно избежать расхождений в экспериментальных данных у разных авторов, работающих в одной и той же области.
В настоящее время не вызывает сомнения, что большая часть, если не все, перевиваемых клеточных штаммов в том виде, в котором они первоначально были получены,состоит из неоднородных в морфологическом и физиологическом отношении клеточных элементов. Поэтому многие авторы считают соблюдение даже неизменного режима культивирования недостаточным для полной воспроизводимости результатов вирусологического эксперимента на тканевых культурах. Нельзя быть уверенным в том, что характер клеточной популяции не изменится под влиянием какого-либо неконтролируемого фактора. Подобно тому как в свое время было сформулировано требование использования в вирусологических исследованиях только чистолинейных животных, так и теперь вирусологи все чаще высказывают мнение о целесообразности замены обычных перевиваемых линий клеток «чистыми» клональными штаммами. С этой целью разработаны и все шире используются специальные методы. Ввиду важности внедрения в вирусологическую практику чистых клональных линий перевиваемых клеток на этих методах следует остановиться несколько подробнее.
До 1948 г. господствовало мнение, что получение клеточных штаммов из отдельных клеток 'принципиально невозможно. Считали, что рост и размножение клеток имеют место только в условиях клеточных ассоциаций, когда множество клеток в результате своего метаболизма выделяют в культуральную среду продукты жизнедеятельности и так изменяют ее свойства, что она .приобретает способность стимулировать клеточное деление. Считали поэтому, что клетки млекопитающих коренным образом отличаются от одноклеточных микроорганизмов (Фишер, 1946). Однако Сэнфорд, Эрл, Лайкели (1948) показали, что отдельные изолированные клетки штамма L мышиных фибробластов, помещенные в капиллярные трубки с небольшим количеством питательной среды из активно размножающейся культуры, начинают делиться и образуют колонии. В дальнейшем метод капиллярных трубок был успешно применен и для выделения других клеточных штаммов {Лайкели, Сэнфорд, Эрл (Likely, Sanford, Earle, 1952)].
Однако недостатком метода капиллярных трубок является то, что лишь небольшой процент изолированных клеток образует колонии. При этом невозможно установить, связана ли столь низкая активность клонообразования с травматическим повреждением клеток или же она отражает действительные различия в потенции их роста и размножения.
