Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
А. И. Микояна). Обработка ткани производится в аппарате с бусами, предложенном А. А. Селивановым, путем периодически повторяющегося перемешивания тканей в растворе (панкреатина при 33—35е в течение 8—10 минут и отсасывания получаемой клеточной суспензии.
Первые две порции клеточной суспензии выбрасывают, остальные помещают в стеклянную колбу и ставят <в тающий лед. Обработку продолжают до полного истощения ткани, т. е. до прекращения отхода клеток. Обычно для этого достаточно 9—12 экстрагирований. Для обработки 20 г эмбриональной ткани в среднем расходуется 500 мл раствора панкреатина.
Полученную суспензию в растворе панкреатина разливают в центрифужные пробирки и центрифугируют на холоде (+4°) при 400 об/мин в течение 20 минут. Отмывают клетки дважды фосфатнобуферным раствором, надосадочную жидкость удаляют. Клетки разводят питательной средой 1 :50. подсчитывают и доводят до концентрации в 1 мл 350000—400000,
Исследования, проведенные Л. В. Колесниковым и Н. Е. Горе-вым, показали, что при обработке эмбриональных тканей человека 0,2% раствором панкреатина жизнеспособные клетки получаются в том же количестве, как и при обработке тканей трипсином.
\/ Увеличение концентрации панкреатина более 0,25% вызывало заметное разрушение клеток (табл. 9).
Таблица 9
Влияние концентрации панкреатина в растворе на клетки, получаемые при обработке тканей
Концентрация Количество клеток, %
панкреатина, % полученное пэ 1 г ткаип
0,2 6-10® 100
0,25 6- 10е 100
0,3 4,2-10fi---4Т4-10'3 71-73
0.5 4,2-105 -5.3-НУ' 7---9
1,0 0 0
В. И. Марченко (1959) предложил использовать 0,5% раствор панкреатина для получения однослойных культур фибробластов человека и куриных эмбрионов, а также для снятия со стекла клеток HeLa при их пересеве.
Автор применил однократное экстрагирование за счет увеличения концентрации панкреатина. Кусочки ткани эмбриона человека троекратно отмывали от крови ев растворе Хэнкса с антибиотиками. Ткань измельчали на кусочки в 2—4 мм ножницами в пенициллиновом флаконе, куда добавляли 3—4 мл раствора Хэнкса с антибиотиками. Жидкость над осевшими кусочками сливали и последние дважды промывали раствором Хэнкса без антибиотиков. Затем осевшие кусочки тканей эмбриона вместе с магнитом помещали в колбу Эрленмейера объемом 100—200 мл с теплым (35—37°) 0,5% раствором панкреатина так, чтобы он покрывал кусочки на 0,5—1 см. Колбу ставили на 20 минут на магнитную мешалку с подогревом, поддерживающим температуру раствора панкреатина. Расход 0,5% раствора панкреатина в среднем составлял 40—50 мл на 15—20 г эмбриональной ткани.
Панкреатизация удается, хотя и несколько хуже, без перемешивания на магнитной мешалке при тщательном пипетировании в растворе кусочков ткани меньшего размера (1—2 мм) в продолжение 20 минут. За это время обычно не происходит полного расщепления всех кусочков, но количества полученного материала от одного эмбриона достаточно для 80 и более пробирок. Увели-
чение времени панкреатизации приводит и большей травматиза-ции клеточного материала и не увеличивает выхода жизнеспособных клеток.
Методика, предложенная В. И. Марченко, оказалась менее экономной в отношении расхода эмбриональной ткани, 'но давала значительную экономию панкреатина.
По своей чувствительности к вирусам панкреатизмрованные культуры не отличались от трипсинизированных.
И, В. Воронцов, О. С. Гудима, Н. А. Колесникова (i960) разработали простой метод получения препаратов, содержащих трипсин и другие ферменты поджелудочной железы. Методика заключается в двукратной обработке панкреатина активированным углем (марка А, ГОСТ 4453—48). В ] л дистиллированной воды взбалтывают 125 г сухого трипсина, суспензию перемешивают в течение часа, затем центрифугируют. К I л надосадочной жидкости добавляют 30 г угля (предварительно промытого дистиллированной водой), тщательно взбалтывают и центрифугируют. К надосадочной жидкости вновь добавляют уголь (продолжительность адсорбции 10 минут), после этого осаждают с помощью центрифугирования частицы угля. Надосадочную жидкость фильтруют через бумажную мязгу слоем 2—3 см на бгохнеровской воронке. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией через свечи Ф-5 и разливают по ампулам. После фильтрации препарат хранят в запаянных ампулах при 4°, при этом активность не снижается в течение 6 месяцев.
По заключению авторов, приготовленные ими растворы по своей активности не уступали трипсину Дифко.
Хуанг, Род и Котчет (1959) провели исследования по замене трипсина очищенным папаином или высушенным неочищенным соком растения Cartca papaya.
Ткань 8—10-дневных куриных эмбрионов и почек эмбриона коровы измельчали и подвергали в колбах Эрленмейера обработке изучаемыми растворами.
Применяли очищенный папаин, содержащий 6000 единиц в 1 мг. Из него готовили растворы с концентрацией 0,05, 0,1.
