Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Анджапаридзе О.Г. -> "Культура ткани в вирусологических исследованиях" -> 33

Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.

Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях — Москва, 1962. — 207 c.
Скачать (прямая ссылка): kulturarkani1962.djvu
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 101 >> Следующая

1 г почки обезьян. Почечную ткань, измельченную на кусочки в 2—4 мм и промытую фосфатнобуферным раствором, помещают в сосуд Боброва объемом 0,5—1 л. Предварительно в сосуд закладывают стерильный магнитик длиной 4 см и диаметром 1 см. Затем к ткани добавляют 0,25% раствор трипсина из расчета 600 мл на две почки или 400 мл на одну. Сосуд Боброва закрывают резиновой пробкой и помещают на магнитную -подогреваемую мешалку.
Перемешивание кусочков ткани продолжается в течение 2*/г—
3 часов и не требует каких-либо дополнительных манипуляций. Признаком достаточной обработки ткани трипсином является отсутствие кусочков во взвеси После окончания трипсинизации взвесь клеток собирают и центрифугируют в течение 30 минут при 200 об/мин. Осадок клеток разводят в питательной среде и разливают в сосуды для культивирования.
Описанные выше модифицированные методы трипсинизации просты, устраняют необходимость 'постоянного вмешательства в
процесс трипсинизации и резко сокращают расход трипсина. Однако они применимы при небольшом объеме работы, а при необходимости обработки больших количеств ткани наилучшие результаты дает дробная трипсинизация в колбах Раппапорт.
Большим препятствием для получения клеточной суспензии в процессе трипсинизации тканей, особенно при работе с амниотическими оболочками человека, является трудность отсасывания взвешенных клеток. Используемая для этой цели аппаратура в виде колб с сифонами и колб с сетчатым дном мало удобна, так как взвешенные в растворе трипсина клетки и кусочки неперева-рившейся ткани быстро забивают отверстия сифона. В этой связи следует признать удачным аппарат Селиванова (1957), представленный на рис. 12.
В предлагаемом аппарате благодаря особому устройству фильтра отсасывание клеточной взвеси значительно облегчено. Аппарат представляет собой цилиндр, изготовленный из нейтрального стекла. В верхней части его имеется горловина, диаметр которой соответствует диаметру резиновой пробки № 27, и стеклянный отвод для поступления трипсина в аппарат. В дно цилиндра впаян тубус длиной 50 мм и диаметром 40 мм с нижним стеклянным отводом для отсасывания диспергированных трипсином клеток.
Внутрь аппарата помещают стеклянные бусы диаметром
2—3 мм, играющие роль фильтра. Они заполняют нижний тубус «а 5—10 мм выше уровня дна цилиндра. В нижнем отводе имеется перетяжка, которая препятствует высыпанию бус из аппарата. Вместо специально изготовленных из нейтрального стекла бус можно употреблять бесцветный бисер, предварительно обработанный хромовой смесью. Через резиновую пробку, закрывающую горловину цилиндра, проходит смеситель, он представляет собой прямую или изогнутую стеклянную палочку, соединенную
Рис. 12. Схема аппарата Селиванова для трипсинизации.
1 — мотор для смесителя, 2 — воздушный фильтр, 3 — цилиндр и поршень шприца, 4 -резиновая пробка, 5— смеситель, 6—бусы, 7—тубус, 8— верхний отвод, ^-иижний
при помощи жесткой резиновой трубки со стеклянным поршнем, проходящим через цилиндр шприца, вставленного в пробку. Цилиндр шприца на 2—3 мм выступает за нижний край пробки. Верхний конец поршня шприца соединяется эластичной резиновой трубкой с осью моторчика, дающего 100—150 -об/мин и обеспечивающего плавное вращательное движение смесителя.
Аппарат перед трипсинизацией стерилизуют в автоклаве отдельно от смесителя. Простерилизованный аппарат помещают в водяную баню при 33—35°. Верхний отвод цилиндра соединяется резиновой трубкой через сифон с сосудом, наполненным раствором трипсина, помещенным в эту же баню. Вторая трубка сифона соединяется с резиновым баллоном, при помощи которого <в аппарат нагнетается трипсин. Нижний отвод соединен резиновой трубкой с погруженной в лед колбой, в которую отсасываются клетки под небольшим вакуумом.
Измельченную ткань в фосфатнобуферном растворе или в растворе Хэнкса вносят в аппарат пипеткой. Аппарат плотно закрывают резиновой пробкой со смесителем. Во избежание излишней механической травмы обрабатываемой ткани и освобождающихся клеток смеситель во время работы не должен касаться бус.
Применение стеклянного бисера в качестве фильтра обеспечивает свободный и быстрый отток клеток независимо от количества отсасываний и массы загруженной в аппарат ткани. Клеточная взвесь отсасывается с помощью вакуумного насоса. Ввиду полного отсасывания клеток на каждом этапе трипсинизации значительно увеличивается выход клеток из трипсинизированной ткани. В процессе трипсинизации клетки полностью сохраняют свою жизнеспособность.
'/Аппарат, предложенный А. А. Селивановым, рекомендуется для широкого использования в лабораториях, занимающихся получением однослойных трипсинизированных тканевых культур.
Из существующих методов получения однослойных культур наиболее популярен метод трипсинизации. Однако рядом исследователей были испытаны и другие ферменты.
Так, для получения однослойных культур Л. В. Колесниковым и Н. Е. Горевым (1958) был применен 0,2% раствор панкреатина (выпуска Московского ордена Ленина мясокомбината имени
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 101 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed