Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Работая над пламенем горелки, проводят монтаж системы для трипсинизации (рис. 8). Ватно-марлевую пробку заменяют резиновой. Резиновые трубки 2 и 3 присоединяют к бутылям с раствором трипсина и фосфатного буфера соответственно. Стеклянный отвод с помощью резиновой трубки соединяют с колбой для сбора клеток, которая хранится на льду.
Рис.
6. Колба для трипсинизации тканей.
Смонтированную колбу помещают на магнитную мешалку. В .нашей практике, как и в практике многих других исследователей, с лучшей стороны зарекомендовала себя магнитная мешалка производства Киевского экспериментального завода.
Ткань в колбе дважды промывают подогретым раствором трипсина, затем добавляют свежую порцию трипсина <в таком количестве, чтобы кусочки были покрыты слоем жидкости высотой
10—15 мм. Колбу 'оставляют на 30 минут при 32°. По истечении
этого времени трипсин сливают, заменяют свежим и включают мотор магнитной мешалки.
Скорость перемешивания должна быть такой, чтобы над магнитом образовалась небольшая воронка и в колбе не наблюдалось образования пены. Через 15 минут мотор выключают, надосадочную жидкость сливают © приемник, добавляют свежую порцию трипсина, подогретого до 32°. Последующие экстракции повторяют до тех пор, пока не прекратится отделение клеток от тканевых кусочков. При интенсивном диспергировании ткани можно в целях экономии трипсина после каждой экстракции промывать тканевые кусочки подогретым фосфатнобуферным раствором. Некоторые авторы рекомендуют такое промывание проводить 2—3 раза подряд до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной (Рапиапорт, 1956).
При трипсинизации двух пар почек (25—35 г ткани) процесс занимает 2—3 часа, число экстракций составляет при этом 20—25. Следует подчеркнуть относительный характер приведенных цифр. На скорость и продолжительность трипсинизации влияют многие факторы: качество раствора трипсина, особенности используемой методики трипсического диспергирования и т. д. Достаточно сказать, что для -полной обработки двух пар почек по методу Раппапорт требуется 8 экстракций (Раппапорт, 1956).
Важным условием получения взвеси жизнеспособных клеток является ’быстрое удаление клеток из смесителя. Это связано с тем, что свободные клетки крайне нестойки и легко разрушаются при механическом перемешивании и длительном воздействии трипсина (Раппапорт, 1956).
Выходы клеток на I г ткани колеблются в очень широких пределах. Е. М. Доссер, Т. Г. Мерцлина, Р. И. Раппапорт (1959) в
Рис, 7, Схема монтажа пробки с сифонами для трипсинизационной колбы.
/—воздушный фильтр, 2—трубка для подачи трипсина, Л—трубка для подачи буферного раствора, ^--соединительные наиюлн.
производственных условиях добились регулярного получения с I г почки 40 млн. клеток, а в отдельных трипсинизационных колбах— 60 млн.
Раппапорт (1956), используя оригинальный аппарат для три-псинизации, достигла сбора 60—80 млн. клеток с 1 г. И. Н. Доброва описала метод, позволяющий получить до 100 млн. клеток с ! г почечной ткани (1959).
Рис. 8. Смонтированная система '.для трипсиниэации тканей.
Клетки, .взвешенные в трипсине, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют в течение 30 минут при 200 об/мин Более высокие скорости применять гае следует, так как исследованиями Раппапорт (1956) показано, что при 400—500 об/мин разрушается значительная часть клеток.
После центрифугирования трипсин сливают через край стакана. Не следует стремиться к полному удалению трипсина. Оставшиеся 2—3 мл не влияют на жизнеспособность клеток после их ресуспеидирования .в питательной среде.
К клеточному осадку добавляют подогретую до 37° (питательную среду. Подогревание среды позволяет предотвратить образование клеточных конгломератов.
После ресуспендирования взвесь клеток переносят из центрифужных стаканов в бутыли. При этом взвеси фильтруют через 2—3 слоя марли, укрепленной в виде мешочка на конце стеклянной трубки.
Для получения равномерной клеточной суспензии в бутыли ее'необходимо тщательно 'перемотать: лля этой пели лучше ис-
пользовать магнитную мешалку. Затем берут пробу для подсчета клеток в суспензии.
Количество клеток подсчитывают в камере Горяева, Томаса. Цейсса, Бюркера и т. д. Рекомендуется предварительно развести суспензию физиологическим раствором в 5 раз. К I части клеточной взвеси добавляют 1 часть 0,1% раствора криста л виол ета в 0,1 н. растворе лимонной кислоты. После перемешивания окрашенную жидкость вносят в камеру.
Рис. 9. Однослойная культура клеток почки обезьян. X 70.
’ Подсчитывают только те клетки, которые имеют ядро и неповрежденную протоплазму. Считают, что большинство таких клеток являются жизнеспособными. Если в поле зрения попадает конгломерат клеток, в которых отдельные ядра окружены большим объемом цитоплазмы, то каждое ядро считают за одну клетку. Конгломераты с ядрами, окруженными небольшим слоем протоплазмы, принимают за одну клетку. Для увеличения точности результатов подсчет следует проводить в нескольких пробах.
