Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Культуры тканей готовы для использования тогда, когда вокруг посаженных кусочков образуется хорошая зона роста клеток (рис. 5). Перед заражением тканей питательную среду в культурах меняют на новую, обычно обедненную питательными веществами и не содержащую сыворотки.
ОДНОСЛОЙНЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
В настоящее время однослойные культуры клеток, растущие на стекле, получили широкое распространение в вирусологических лабораториях и практически вытеснили остальные методы выращивания клеток вне организма. Это связано с тем, что од-нослойные культуры представляют наиболее удобную модель для
изучения биологических свойств вирусов, процессов взаимодейст вия вируса и клетки и позволяют получать большие объемы ви руссодержащей жидкости с высокими инфекционными титрами.
В основе метода лежит обработка тканевых кусочков с цельи получения суспензии отдельных клеточных элементов протеолити ческими ферментами, такими, как трипсин, панкреатин, папаин ) коллагеназа (Делбекко, 1952; Л. В. Колесников, Н. Е. Горев 1958; Хуанг, Род, Котчет (Huang, Rohde, Kotschate, 1959); Хини Сивертон (Hinz, Syverton, 1959)], действие которых заключает ся в разрушении межклеточных протоплазматических мостиков Несмотря на положительные результаты, свидетельствующие < возможности использования панкреатина, папаина и коллагена зы, практически повсеместно при приготовлении однослойны: культур используется трипсин.
Применение трипсина для диспергирования клеток было опи саио в 1916 г. Ру и Джонсом (Rous, Jones, 1916). Однако широ кое внедрение этого метода в практику связано с именем Дел бекко и Фогт (1952, 1954), которые показали возможность при готовления однослойных культур из тканей куриных эмбрионо1 и почек обезьян.
Методика трипсинизации тканей, предложенная Делбекко I Фогт и заключающаяся в простом пипетировании, претерпел; значительные изменения. Янгнер в 1954 г. для ускорения процес са трипсинизации применил перемешивание фрагментов ткан! в растворе трипсина с помощью механической мешалки. В по следующем были предложены различные изменения, особенно i отношении формы сосудов для трипсинизации, температурной режима и способа перемешивания (И. Н. Доброва, 1959; Бодиа! (Bodian, 1956); Барский, Лами, Лепин (Barski, Lamy, Lepine
1955); Даниель, Депо (Daniel, Depoux, 1957); Мельник, Раппа порт, Бенкер, Бхетт (Melnik, Rappaport, Banker, Bhatt, 1955)].
Детальное описание отдельных этапов трипсинизации дано ] работе Раппапорт (1956).
Большой вклад в развитие методов получения культур ткаш в производственных условиях сделан Е. М. Доссер с сотрудника ми (1959).
Приготовление суспензии клеток. Как показал опыт большое работы лаборатории культивирования тканей Московского науч но-исследовательского института вирусных препаратов (заведую щая лабораторией Е. М. Доссер), многие ткани могут быть ди спергированы с помощью трипсина по единой методике. Этг методика представляет модификацию процедуры, предложенью! Янгнером (1954), и сводится к следующему.
Почку1 извлекают из стаканчика и переносят в чашку Пет ри. Затем ножницами и пинцетом удаляю^ капсулу и разрезаю'
1 Поскольку основные этапы процесса трипсинизации 'разработаны для по чек обезьяны, мы даем описание режима диспергирования этого органа.
почку пополам (для уменьшения возможности бактериального загрязнения после каждой операции меняют инструменты), иссекают лоханку с окружающей соединительной тканью и мозговым веществом.
Корковое вещество помещают в широкий центрифужный стаканчик. В этом стаканчике ножницами измельчают ткань на кусочки размером в 2—3 мм.
Измельченную ткань многократно промывают фосфатнобу* ферным раствором до тех пор, пока не удалят следы крови: фосфатнобуферный раствор должен стать прозрачным.
Ткань из фосфатнобуферного раствора переносят в колбу для трипсинизации, в которую заложен' магнит-мешалка, заключенный в резину.
Этот магнит стерилизуют кипячением в дистиллированной воде.
Колбы, используемые при трипсинизации, представляют собой тонкостенные сосуды типа колб Эрленмейе-ра. На боковых поверхностях колбы должны быть сделаны вмятины, выступающие во внутреннюю полость на 1—2 см. Число (вмятин обычно три и идут они от дна к горлышку колбы.
Эта модификация сосуда допускает хорошее перемешивание ткани и трипсина, На расстоянии 2/з высоты от дна колбы расположен стеклянный отвод.
У его основания, на внутренней поверхности, расположена стеклянная решетка для задержки кусочков при сливе жидкости {рис. 6).
Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и стерилизуют в течение 12 минут при 2 атм. Одновременно с колбой стерилизуют соответствующую диаметру ее горла резиновую пробку. В пробке имеется три отверстия: через одно проходит стеклянная трубка с воздушным фильтром (/), через второе — трубка для подачи трипсина (2), через третье—трубка, по которой поступает буферный раствор (<?) (рис. 7), На свободный конец трубки 2 и 3 надевают резину длиной 50—70 см, другой конец этой трубки закрывают пастеровской пипеткой и помещают в пробирку.
