Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Анджапаридзе О.Г. -> "Культура ткани в вирусологических исследованиях" -> 26

Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.

Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях — Москва, 1962. — 207 c.
Скачать (прямая ссылка): kulturarkani1962.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 101 >> Следующая

Реактивы.
1. Основной 5% раствор казеина из очищенного препарата, pH 7,7.
2. Рабочий раствор казеина (0,25%) готовится непосредственно перед употреблением: 5 мл 5% раствора казеина, 10 мл М/15 фосфатного буфера (pH 7,7) (воды дистиллированной до 100 мл).
3. 5% трихлоруксусная кислота.
4. Физиологический раствор.
Определение, а) Стандартную пробу получают смешением 0,5 мл 0,25% раствора казеина, 1,5 мл физиологического раствора и 3 мл 5.% трихлоруксуоной кислоты. Коэффициент экстинкции определяют через 2 минуты после смешивания с помощью фото-электроколориметра (ФЭК-М).
При исследовании испытуемых растворов трипсина казеина берут в 2 раза больше (1 мл). Если мутность в исследуемой пробе будет равна мутности в стандартной лробе, это значит, что перевариванию подверглось 50% взятого казеина. Условно принимается, что активность раствора трипсина, вызывающая такое расщепление, равна единице.
>б) Готовят разведения исследуемого раствора трипсина 1 :2; 1:4; 1 :8 и т. д. 1 мл каждого разведения смешивают с 1 мл 0,25% раствора казеина и инкубируют в течение 30 минут при 37°. Сразу после этого в каждую пробирку добавляют 3 мл 5% раствора трихлоруксуоной кислоты и через 2 минуты определяют коэффициенты экстинкции с помощью фотоэлектроколориметра. Отмечают пробы с экстинкцией, наиболее близкой к стандартной пробе. Пробы с коэффициентом экстинкции, равным стандарту, содержат 1 единицу активности трипсина, что соответствует рас* щеплению 50% взятого количества казеина.
При определении активности 0,3% растворов Дифко 50% расщепления казеина отмечается в интервале разведений раствора трипсина — между 1:96 и 1:122, что соответствует 38 000—
51 000 единиц на 1 г фермента.
Раствор трипсина должен иметь активность не менее 96— 122 единиц.
Определение протеолнтической активности трипсина по желатине. Протеолитическую активность трипсина по желатине можно определить, применяя фотопленку, так как в состав эмульсии фотопленки входит желатина. Фотопленка должна быть предварительно засвечена и проявлена. Для получения сравнительных данных активности трипсина желательно пользоваться фотопленкой одного сорта с одинаковой толщиной эмульсионного слоя.
Готовят разведения трипсина в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза и из каждого разведения наносят по 1 капле на фотопленку. Затем пленку шомещают в термостат при температуре 37° на 30 минут.
Пленку промывают водой, после чего на пленке появляются прозрачные круги в местах нанесения капель трипсина вследствие того, что трипсин вызвал гидролиз желатины.
Условно за активность трипсина принимают то наибольшее разведение, при котором появился прозрачный кружок.
ТКАНИ И ИХ ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА
Для получения культур могут быть использованы разнообразные ткани как животных, так и человека. Вопрос о выборе ткани решается в зависимости от свойств изучаемого вируса и задач, стоящих перед экспериментатором. Так, например, при изучении кишечных вирусов, и в первую очередь Еирусов полиомиелита, наиболее широко применяются культуры клеток почечного эпителия обезьян и ткани эмбриона человека. Для исследования трансмиссивных вирусов, в том числе и вируса весенне-летнего клещевого энцефалита, широко используют культуры куриных фибро-бластов и клеток почек эмбрионов свиньи.
Получение и способы предварительной обработки наиболее употребляемых тканей следует рассмотреть подробнее.
Для .приготовления культур человеческих фибробластов используют эмбрионы в возрасте 8—14 недель, которые получают в виде соскоба полости матки после искусственного аборта. Со-скобы помещают в стерильную стеклянную посуду. В боксе доставленный материал выкладывают на стерильную эмалированную кювету, а затем извлекают необходимые органы и ткани (сердце, легкие, кожно-мышечные фрагменты и т. д.). Эти органы переносят в чашку Петри или широкую пробирку с солевым раствором (Хэнкса, Эрла, Рингера и др.), содержащим в 1 мл от 200 до 400 ЕД пенициллина и стрептомицина. Указанным раствором ткань промывают 3—4 раза для максимального удаления форменных элементов крови. Обработанные ткани исследуют на стерильность. Следует отметить, что выход жизнеспособных клеток зависит от срока хранения ткани до момента приготовления культур: чем короче этот период, тем выше процент жизнеспособных клеток (Е. М. Доссер, Т. Г. Мерцлина, Р. И. Рапопорт, 1959).
Широкое применение для изучения вирусов полиомиелита и кори находят культуры амниона человека [Лахелл (Lahelle, 1956); Вайнштейн, Александер и др.; (Weinstein, Alexander et al.,
1956); Зитцер, Фог, Даннебак (Zitcer, Fogh, Dunnebacke, 1955)].
Для получения этих культур рекомендуют брать плаценту молодых рожениц. Детское место сразу же после родов помещают в стерильную посуду; если нет возможности взятую ткань обработать в тот же день, то ее оставляют при комнатной температуре в солевом растворе с антибиотиками. Следует отметить, что хранение неблагоприятно влияет на последующие результаты культивирования (Е. М. Доссер, Т. Г. Мерцлина, Р. И. Рапопорт, 1959).
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 101 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed