Культура ткани в вирусологических исследованиях - Анджапаридзе О.Г.
Скачать (прямая ссылка):
70°/о среды 199 в растворе Эрла 20% триптозофосфатного бульона 10% сыворотки теленка
Клетки MS могут расти, если компоненты среды 199 заменит! на 0,5% гидролизат лактальбумина на растворе Эрла и дополни тельно ввести в среду 0,375 г/л глутамина и 2 г/л глюкозы.
Исследования по упрощению синтетических сред проводшша также и в направлении уменьшения содержания в них сыворотог и введения в состав сред ферментативных гидролизатов некото рых белковых веществ.
15. Среда МК Мельника и Рнордан (Riordan, 1952) для куль тивирования самых различных клеток.
NaCl ......................................... 8 г
КС1 .......................................... 0,4 *
CaCIj ........................................ 0,14 »
MgSCWHaO...................................... 0,1 »
ЫагНР04 ¦ 2НгО ... ..................... 0,06 »
MgCb-6H20 ...... ................ 0,1 »
КНгР04 ....................................... 0,06 »
№НСОз ......................................около 0,15 г
Г люкоза ..................................... 1 г
Феноловый красный ........................ ... 0,02 »
Лактальбумин (гндролизат) .................... 5 »
Сыворотка бычья (молодых животных)............ 20 мл
Вода бидистиллированная, перегнанная в стекле 1000 »
Среду приготавливают следующим образом (расчет на 10 л). Готовят до; основных раствора.
Раствор А
NaCI ...................................................80 г
KCI .................................................... 4 *
MgSOi .................................................. 1 »
MgCb ................................................... 1 »
Указанные соли последовательно растворяют в 300 мл биди-стиллированной воды.
Отдельно растворяют 1,4 г СаС12 (безводного) в 60 мл биди-стиллированной воды и медленно добавляют при перемешивании к остальному раствору. При наличии увлажненной соли готовят концентрированный раствор, в котором содержание CaCI; определяется путем титрования хлоридов по Мору. Полученный раствор СаСЬ добавляют к раствору А по соответствующему расчету на безводный СаСЬ. Общий объем раствора А доводя! до 500 мл б и д 1! ст и л л Vi ров а иной водой.
Раствор Б
NasHP04-2H20 .................................. 0,06 г
КН2РО, ................... ................. 0,06. »
Глюкоза ................................. 1 »
Феноловый красный ............................. 0,02 »
Бидистиллированная вода .....................до 500 мл
Затем сливают 500 мл раствора А и 500 мл раствора Б, добавляют 50 г гидролизата лактальбумина, предварительно суспендированного в 1 л бидистиллированной воды, и добавляют ^00 мл бычьей сыворотки. Общий объем доводят до 10 л бидистиллированной водой.
Раствор хорошо перемешивают, доводят pH с помощью 8% раствора двууглекислого натрия до 7,1—7,4.
Определение pH производят с помощью шкалы буферных растворов с индикатором феноловым красным или электрометрически. Готовый раствор пропускают через фильтр Зейтца (пластины EKS-2). Перед стерилизацией для промывания пластины пропускают стерильную бидистиллированную воду из расчета 200 мл на каждую .пластину.
Первые порции фильтрата 500 мл не употребляют. Сбор фильтрата производят в стеклянные бутыли с соблюдением правил асептики закрытым путем.
Среда с 0,5% гидролизатом лактальбумина в растворе Хэнкса с 2% бычьей сыворотки хранится при 4—6° в течение 3 месяцев.
В лабораторной практике может быть применен другой способ приготовления этой среды.
Готовят отдельно 5% раствор лактальбумина, для этого 25 г гидролизата лактальбумина растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. Раствор автоклавируют 10 минут при давлении 0,7 кг/см2. Раствор хорошо сохраняется в рефрижераторе. Если образуется преципитат, то «го удаляют легким центрифугированием.
Готовят раствор Хэнкса 10-кратной концентрации.
NaCl ..................................... 80 г
КС1 ............................................ 4 »
СаСЬ ........................................... 1,4 »
MgSCV7HsO....................................... 1 >
MgCl2-6H20 ..................................... 1 »
NasHP04 ........................................ 0,6 »
КН2РО„ ......................................... 0,6 »
Глюкоза ........................................ Ю »
Феноловый красный (0,5% раствор)................ 40 мл
Воды ...........................................до 1 л
Среду стерилизуют фильтрованием.
Из этих двух основных растворов готовят в стерильных условиях основную среду, которую используют для выращивания
