Компьютерный анализ генетических текстов - Александров А.А.
ISBN 5-02-004691-4
Скачать (прямая ссылка):
Силы, стабилизирующие вторичную структуру РНК. Для определения ста бильности спиралей нуклеиновых кислот биологи вначале использовали, можно сказать, визуальный, статистический метод - оценивали на глаь содержание G-С и A-U пар в спирале. Это казалось вполне подходило для качественных выводов, однако в 1963 г. Чемберлен с соавт. (Chamberlir. et al., 1963) четко показали на синтетических полимерах влияние последовательности оснований на стабильность. Энтальпия спирали, имеющей, например, две G-С пары, будет очень сильно разнится в зависимости от того, являются ли эти пары ближайшими соседями или между ними расположена A-U пара. Чтобы объяснить этот результат, надо учесть так называемые вертикальные или стэкинг-взаимодействия.
Одна из первых попыток оценить взаимодействия между основаниями в двухспиральной структуре была предпринята в работе Де Во и Тиноко в 1962 r.(De Voe, Tinoco, 1962). Результат этой работы казался в ту пор;: немного неожиданным.Наибольший вклад в стабильность спирали давали не водородные связи, соединяющие комплементарные основания, благодаря которым и образуется двойная спираль, а ван-дер-ваальсовы силы, действующие в стопке между основаниями. Впоследствии во многих работах более точно оценивались стэкинг-взаимодействия (Pullman, 1968), но общий вывод о преимущественном значении этих сил оставался неизменным. Из всех работ следовал еще один существенный вывод о том, что для оценки стабильности спирали достаточно учесть взаимодействия только между ближайшими основаниями - так называемая модель ближайших соседей. Это заключение сделало реальным возможность экспериментально оценить термодинамические параметры, характеризующие стабильность спирали.
Термодинамика образования спиралей исследовалась с помощью оптических и калориметрических методов (см..например,Кантор, Шиммел, 1984). К сожалению, определение энтальпии и энтропии чувствительно к тому, каким способом проводились измерения. Различия могут достигать 50 ккал/моль. Однако различия в величинах свободной энергии, определенной разными способами, значительно меньше, возможно, благодаря тому, что расхождения энтальпии и энтропии компенсируют друг друга. Так, например, из результатов, представленных в работе (Borer et al., 1974), видно, что для олигонуклеотида A7U7 величины свободной энергии образования спирали, полученные разными методами в интервале от 25 до 50 , отличаются не более чем на 1 ккал/моль.
Определение термодинамических параметров. Определение термодинамических параметров обычно проводится из данных по плавлению олигонуклеотидов. Анализ кривых плавления коротких двуспиральных фрагментов позволяет получить термодинамические характеристики в зависимости от последовательности оснований. При помощи дисперсии оптического вращения (используются также другие спектроскопические методы, а также протонный магнитный резонанс) можно получить кривые зависимости поглощения при изменении температуры. Сравнивая кривые поглощения одно- и двуспи-
ральных олигонуклеотидов, можно определить f - долю спаренных оснований. Из этой величины можно получить Кс - константу равновесия образования двуспирального фрагмента (Borer et al.,1974)
2f
К =--------------,
(l-f)2C
где С - общая концентрация олигонуклеотидных нитей.
Это уравнение описывает ситуацию, когда в растворе находятся одинаковые молекулы РНК с комплементарными участками в цепи. Изменение стандартной свободной энергии при образовании спирального участка в этом случае равно
бС° = -RTmlnC,
где Тт - температура, при которой f=1/2. Из уравнения Вант-Гоффа можно определить энтальпию этого процесса:
R d(in С)
бН° = ------------- .
d (1/TJ
Таким образом, из данных по плавлению РНК, построив кривые зависимости 1/Тя и 1пС, можно получить полный набор термодинамических параметров - свободную энергию, энтальпию и энтропию образования спирали.
Инициация образования спиралей. Обязательным условием при образовании первой инициирующей пары спирали является образование петли. Различные типы петель представлены на рис.6.1. Термодинамика образования петель была подробно исследована в работе (Uhlenbeck et al., 1973;Gralla, Crothers, 1973).
Стандартную энтальпию процесса образования петли - Н° можно вывести из уравнения Вант-Гоффа:
Е° = 4RTm2 (fn/T),
где f - доля петель в системе; Тт - температура, при которой fn=0,5.
Стандартная свободная энергия равна 0 при Тт и, следовательно, S0 -стандартная энтропия образования петли равна
S°=H0/Tm.
Свободная энергия образования петли - это фактически свободная энергия инициации спирали. На этапе инициации цепь сворачивается сама на себя, сближая комплементарные основания таким образом, чтобы между ними могла возникнуть водородная связь. Это приводит к образованию
