Компьютерный анализ генетических текстов - Александров А.А.
ISBN 5-02-004691-4
Скачать (прямая ссылка):
Оптимальное планирование биохимических экспериментов по картированию. Построение физических карт на ЭВМ освобождает экспериментаторов от рутинной и трудоемкой работы и дает возможность получать подробные физические карты (порядка 10 сайтов по каждой рестрикта-эе), построение которых без помощи ЭВМ невозможно. Однако построение физических карт с 10-20 сайтами по каждой рестриктазе (при использовании только информации об одиночных и совместных рестрикциях) сталкивается с серьезными вычислительными трудностями даже на современных ЭВМ. В разделе 5.6 обсуждаются возможности дополнительных биохимических экспериментов, которые позволяют иногда обойти математические проблемы построения физических карт за счет получения (довольно трудоемкого) биохимическими методами информации о порядке расположения рестрикционных фрагментов (при использовании таких методов требования к точности определения длин фрагментов снижаются). Привлечение информации о дополнительных биохимических экспериментах дает возможность строить очень подробные физические карты (20-50 сайтов по каждой рестриктазе). Работа с ЭВМ в режиме диалога позволяет свести к минимуму и экспериментальную работу по картированию - при этом минимизируется количество электрофорезов и указывается минимальный набор дополнительных биохимических экспериментов, необходимых для построения физической карты.
5.2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ
Использование маркеров для определения размеров фрагментов. Рестрикционные фрагменты можно разделить с помощью электрофореза. На схеме электрофореграммы (рис.5.3) .полученной при разделении HindiII-фрагментов ДНК фага SM Pseudomonas aeruginosa, видны четыре полосы, каждая полоса соответствует одному рестрикционному фрагменту. Длина пробега фрагмента в геле зависит от его размеров (молекулярного веса): чем больше фрагмент,тем меньшее расстояние в геле он проходит. Зная зависимость D(R), можно по длине пробега восстановить длины рестрикционных фрагментов (через R обозначен размер фрагмента, через D - длина пробега в геле). Однако получение аналитических формул для зависимости D(R) (Slater et al.,1987) затруднено. В реальных биохимических экспериментах по картированию аналитические формулы обычно не используются, вместо них для определения зависимости D(R) проводится электрофорез с фрагментами, размер которых заранее известен (такие фрагменты называются маркерами). В правой дорожке на рис.5.3 представлены пять полос, соответствующих маркерам. Эти полосы можно использовать для определения размеров фрагментов фага SM
%f, Заказ № 4327 2 6'
Pseudomonas aeruginosa. На рис.5.5 по размерам маркирующих фрагментов и их длинам пробегов построена интерполяционная кривая, которая позволяет оценить размеры фрагментов фага SM Pseudomonas aeruginosa.
Методы аппроксимации для определения размеров фрагментов. Для аппроксимации длин рестрикционных фрагментов по длинам маркеров было предложено несколько подходов.
Саузерн(Southern,1979} предложил для расчета размеров фрагментов соотношение:
D(R)= c/(R-R0)+D0, где R0,D0,c - некоторые константы.
Р и с.5.5. Интерполяционная кривая, построенная по длинам пробегов пяти маркеров, представленным на рис.5.3 (для наглядности по оси абсцисс отложен ln{R), а не R).Ha интерполяционной кривой отмечены три точки, соответствующие фрагментам рестриктазы BamHI
Для вычисления параметров R0,D0,c необходимы, по крайней мере, три маркера (эти маркеры целесообразно выбирать так, чтобы анализируемый фрагмент лежал между ними). Соотношение Саузерна можно использовать в двух формах: локальной и глобальной
(Schaffer,Sederoff,1981). В первом случае при определении размера фрагмента используется информация только о маркерах,близких по размеру к анализируемому фрагменту, а во втором - обо всем множестве маркеров(при этом используется метод наименьших квадратов). Следует отметить, что хотя использование соотношения Саузерна в глобальной
форме более полно использует информацию о маркерах, тем не менее в локальной форме оно дает более высокую точность в определении длин фрагментов (Elder,Southern,1983). Это вызвано тем, что параметры R0, D„,c остаются постоянными только в узких интервалах длин пробегов.
Другой подход к определению размеров фрагментов связан с кусочнолинейной интерполяцией зависимости логарифма R от D, а также с аппроксимацией этой зависимости кривой 2-го порядка (Duggleby et al.,1981) или третьего порядка(Russels et al.,1984):
ln(R)=a3D3+a2D2+a1D1+a0.
Сравнительный анализ методов аппроксимации ( ортогональными полиномами; кубической сплайн-функцией; кусочно-линейной функцией; с помощью соотношения Саузерна в локальной форме) показал, что лучшие результаты дает аппроксимация кубической сплайн-функцией (Gough,Gough,1984). Пехов и др.(1985) предложили специальный метод, позволяющий экстраполировать размеры фрагментов, не укладывающихся в шкалу маркеров.
